Модификации гистонов, ассоциированные с эухроматином и факультативным, и конститутивным гетерохроматином, суммированы в табл. 17.1. До сих пор лишь Xi, но не конститутивный гетерохроматин, оказалась обогащенной метилированием H3K27 и убиквитинированием гистона H2A по лизину 119 (H2AK119ub) (Plath et al., 2003; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004).
Все модификации, перечисленные в табл. 17.1, ассоциированы с общей, гетерохроматиновой конформацией неактивной Х-хромосомы и были идентифицированы с помощью иммунофлуоресцентного анализа либо метафазных хромосом, либо тельца Барра в интерфазных клетках. Однако локальные изменения в модификациях гистонов могут также играть важную роль на различных этапах процесса Х-инактивации. Такие изменения могут быть идентифицированы с помощью микроскопии высокого разрешения или с помощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) для того, чтобы картировать модификации, которые объяснялись в главе 10, внутри или по соседству с критичным районом Xic. Например, в недифференцированных ES-клетках крупный домен, простирающийся более чем на 340 т. п.н. в 5’-направлении от гена Xist, характеризуется гиперметилированием H3K9. Гиперметилирование уменьшается по мере того, как клетки дифференцируются и продолжается Х-инактивация (Heard et al., 2004). В женских ES-клетках тот же общий район хроматина обогащен метилированными H3K27 (Rougeulle et al., 2004), а сайты внутри него обогащены ацетилированными H3 и Н4 (O’Neill et al., 1999). Проводимые в настоящее время исследования должны показать, в какой мере эти локальные модификации гистонов в районе Xic являются ранними каузативными событиями, приводящими в действие процесс Х-инактивации, и в какой степени — событиями, совершающимися «вниз по течению» и являющимися (возможно, существенными) компонентами идущего процесса ремоделинга хроматина.
Указаны модификации гистонов, которыми обогащен (+) или обеднен (-) конститутивный и факультативный гетерохроматин по сравнению с эухроматином. Символ «означает, что уровень модификации неотличим сколько-нибудь от эухроматина. (me) — метилирование. Относится ко всем способным ацетилироваться лизинам. Обогащение в локальных «горячих пятнах», но не повсюду. Временное обогащение в некоторых клеточных типах.
Конститутивный центрический гетерохроматин обогащен метилированной ДНК, прежде всего 5’-метилцитозином в димерах CpG (глава 18). Это согласуется с его низким уровнем транскрипционной активности Как это, возможно, ни удивительно, уровень метилирования CpG на Xi в целом не является существенно более высоким, чем в остальном геноме. Однако специфические «островки» CpG, ассоциированные с «молчащими» генами, в высокой степени метилированы, и экспериментальные данные позволяют предполагать, что метилирование ДНК играет важную роль в стабилизации неактивного состояния. Так, мыши, у которых отсутствуют ферменты, которые либо метилируют немодифицированные до этого CpG (de novo метилтрансферазы ДНК, Dnmta и Dnmtb), либо поддерживают модификацию прежде модифицированных остатков (поддерживающий энзим, Dnmtl), инициируют и осуществляют случайную Х-инактивацию нормальным образом (Sado et al., 2000, 2004). Однако гены на гипометилированной Xi у этих мутантных мышей реактивируются легче, чем Xi у животных дикого типа с нормальными уровнями метилирования (Sado et al., 2000).
4.3. Энзимология модификаций гистонов на Хi
Ферменты, отвечающие за ацетилирование коровых гистонов (HDACs) во время Х-инактивации или за деметилирование H3K4, пока неизвестны. Поскольку ингибитор деацетилазы трихостатин A (TSA, trichostatin А) может предотвращать или, по крайней мере, задерживать появление деацетилированной X в дифференцирующихся женских ES-клетках, есть основания предположить участие HDACs (O’Neill et al., 1999). Однако мы не знаем, какие из 11 HDACs класса I и II отвечают за это вероятнее всего (энзимы класса III не подавляются TSA). Мы не знаем также механизм, ответственный за удаление метилирования H3K4. Ферменты, способные удалять метальные группы с H3K4, находящихся в моно- или диметилированном состоянии, были идентифицированы только недавно, а ферменты, способные деметилировать H3K4 в триметилированном состоянии, еще предстоит открыть. На этом этапе мы не можем исключить, что метилирование H3K4 и (или) деапетилирование гистонов удаляются с Xi путем замещения гистонов или же пассивным образом в ходе репликации ДНК.