1. Механизм клеточной памяти
1.1. Гипотеза
В клетках млекопитающих метилирование цитозина происходит преимущественно в динуклеотидах CpG (рис. 18.1). Мысль о том, что метилирование ДНК у животных могло бы представлять механизм клеточной памяти, возникла независимо в двух лабораториях (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Отдавая себе отчет в том, что динуклеотид CpG является самокомплементарным, обе группы предположили, что паттерны метилированных и неметилированных CpG могли бы копироваться при делении клеток. Сразу же после репликации ДНК родительская нить ДНК сохраняла бы свой паттерн модифицированных цитозинов, но вновь синтезированная нить была бы немодифицированной. Для того чтобы обеспечить копирование родительского паттерна на эту дочернюю нить, они постулировали существование «поддерживающей метилтрансферазы», которая метилировала бы исключительно те CpG, которые спарены основаниями с метилированным родительским CpG. Неметилированные CpG не являлись бы субстратом для поддерживающей метилтрансферазы (рис. 18.2). Следствием работы этого простого механизма была бы полуконсерватавная репликация паттернов метилирования ДНК, подобно нуклеотидной последовательности самой ДНК
1.2. Данные о наследуемых паттернах метилирования
Паттерн метилирования ДНК в единичном геномном локусе первоначально был установлен с помощью рестрикционных эндонуклеаз, чувствительных к метилированию ДНК.
Рис. 18.1. Метилирование цитозинов в ДНК
(а) добавление метильной группы (красный цвет) в положении 5 пиримидинового кольца цитозина (черная стрелка) стерически не интерферирует со спариванием оснований ПС (голубые линии). ДНК-метилтрансферазы ковалентно связываются с углеродом в положении 6 (зеленая стрелка) во время переноса метильной группы (б) Модель В-формы ДНК, метилированной по цитозинам в двух самокомплементарных последовательносях CpG. Спаренные метальные части (пурпурный и желтый цвета) лежат в большой бороздке двойной спирали
Многие из этих ферментов не могут расщеплять сходные распознаваемые ими последовательности в ДНК, если имеет место метилирование специфического основания. Паттерн метилированных и неметилированных сайтов был картирован в генах рибосомной РНК Xenopus laevis с помощью таких энзимов, о которых известно, что они расщепляют ДНК по сайтам, содержащим CpG, но блокированы метилированием цитозинов (Bird and Southern, 1978). Нашли, что на конкретной нити ДНК большинство CpG метилированы, но что неметилированные сайты распределены случайным образом. Существенно, что эти сайты были всегда симметричными. Другими словами, либо оба CpG в комплементарной паре были метилированы, либо ни один из них не был метилирован (Bird, 1978). Это открытие вполне соответствовало предсказаниям, сделанным на основе модели поддержания (Holliday and Pugh, 1975; Riggs, 1975). Более прямая проверка наследуемости паттернов метилирования Д Н К стала возможной при использовании трансфекции искусственно метилированной ДНК в культивируемые клетки (Wigler, 1981). Неметилированные плазмиды обычно не становятся метилированными, даже после многих клеточных поколений. Однако плазмиды, которые были метилированы по сайтам CCGG метилтрансферазой M.Hpall, сохраняют свой метилированный статус на протяжении многих поколений, хотя надежность этого процесса, по крайней мере у культивируемых клеток, меньше 100 %.
1.3. Поддерживающая ДНК-метилтрансфераза млекопитающих
Прогресс в понимании любого биологического процесса на молекулярном уровне зависит от выделения ключевых игроков. Активность ДНК-метилтрансферазы была довольно рано обнаружена в грубых клеточных экстрактах, но в конечном счете ее удалось очистить как белок с массой, 200 кД (Bestor and Ingram, 1983). Фермент Dnmtl специфичен для CpG и обладает значительной активностью против неметилированной ДНК. Однако предпочтительным ДНК-субстратом для него является ДНК, метилированная по CpG только на одной нити (так называемая полуметилированная ДНК), в силу этого свойства казалось возможным, что это поддерживающая ДНК-метилтрансфераза. Последующие исследования существенно подкрепили этот взгляд, поскольку инактивация Dnmtl в эмбриональных стволовых клетках мыши (табл. 18.1) ведет к утрате метилирования CpG по всему геному (Li et al., 1992). Имеющиеся данные согласуются с точкой зрения, согласно которой Dnmtl поддерживает метилирование ДНК по CpG, завершая метилирование полуметилированных сайтов, как постулировали Риггс с Холлидеем и Пью (рис. 18.2).