2. Происхождение паттернов метилирования ДНК
2.1. De novo метилирование ДНК у ранних эмбрионов
Нам необходимо понять не только то, каким образом паттерны метилирования ДНК стабильно поддерживаются, но и то, как они вообще возникают Ранние эксперименты по трансфекции клеток показали, что неметилированная ДНК, введенная в культивируемые соматические клетки, имеет тенденцию оставаться в неметилированном состоянии спустя много клеточных делений. С другой стороны, ретровирусные провирусы и другие трансгены, введенные мышиным предимплантапионным эмбрионам, становятся стабильно метилированными в клетках животного (Jahner et al., 1982). Это позволяло предполагать, что процесс de novo метилирования ДНК ограничен тотипотентными стадиями эмбриогенеза. Эта идея была проверена с помощью клеток эмбриональной карциномы (ЕС) мышей и, впоследствии, эмбриональных стволовых (ES) клеток в качестве модельной системы. Ретровирусная ДНК была неинфекционной, будучи введенной в эти клетки, в противоположность соматическим клеткам, которые поддерживали инфекционный цикл вируса (Stewart et al., 1982). Кроме того, провирусная ДНК становилась метилированной по динуклеотидам CpG, а уменьшение метилирования путем клонирования их метилированных геномов в бактериях (и тем самым стирание метилирования ДНК) восстанавливало способность к экспрессии вирусного гена. Эти результаты показывали, что метилирование ДНК может сайленсировать экспрессию вирусного генома in vivo, а также что эмбриональные клетки действительно обладают способностью метилировать ДНК de novo. Первоначально была известна только одна ДНК-метилтрансфераза, Dnmt 1, и поэтому считалось, что этот фермент способен de novo метилировать ДНК на этих стадиях развития. Делеция гена Dnmtl, однако, не интерферирует с de novo метилированием провирусной ДНК в ES-клетках (Lei et al., 1996), доказывая, что работают другие ДНК-метилтрансферазы.
Рис. 18.2. Метилирование de novo и поддерживающее метилирование ДНК
Отрезок геномной ДНК показан как линия с самокомплементарными парами CpG, маркированными как вертикальные штрихи. Неметилированная ДНК (верхняя часть рисунка) становится метилированной “de novo” благодаря Dnmt3a и Dnmt3b и дает в результате симметричное метилирование в определенных парах CpG. После полуконсервативной репликации ДНК дочерняя нить ДНК спарена основаниями с одной из метилированных родительских нитей (другой продукт репликации не показан). Симметрия восстанавливается поддерживающей ДНК-метилтрансферазой Dnmtl, которая завершает метилирование полуметилированных сайтов, но не метилирует немодифицированные CpG
2.2. Открытие de novo метилтрансфераз
Все известные прокариотические цитозиновые ДНК-метилтрансферазы обладают общим набором диагностических белковых мотивов (Postfai et al., 1989). Эти особенности были обнаружены и у поддерживающей ДНК-метилтрансферазы Dnmtl. Поиски в базах данных по тегам экспрессируемых последовательностей (EST) выявили три транскрипта, которые потенциально могли кодировать дополнительные ДНК-метилтрансферазы (рис. 18.3). Один из кандидатов, белок Dnmt2, обладает миниальной ДНК-метилтрансферазной активностью in vitro и его отсутствие не оказывает никакого заметного влияния на уровни метилирования ДНК. Другие два кандидата, Dnmt3a и Dnmt3b, кодировали родственные каталитически активные полипептиды, которые, в отличие от Dnmtl, in vitro не проявляли никакого предпочтения в отношении метилирования полуметилированной ДНК (Okano et al., 1998). Дизрупция генов, кодирующих Dnmt3a и Dnmt3b у мышей, подтвердила, что эти белки представляют собой недостающие de novo метилтрансферазы (табл. 18.1), поскольку ES-клетки и эмбрионы, лишенные этих белков, были неспособны к метилированию de novo провирусных геномов и повторяющихся элементов (Okano et al., 1999). Более того, мужские и женские зародышевые клетки, лишенные белка Dnmt3a или ассоциированного регуляторного фактора, Dnmt3L, не могли установить отличающиеся паттерны метилирования в импринтированных генах (табл. 18.1) (Hata et al., 2002; Kaneda et al., 2004). В то время как инактивация и Dnmt3a, и Dnmt3b приводила к ранней эмбриональной летальности, утрата любого из этих генов вызывала серьезные дефекты, приводящие к постнатальной (Dnmt3a) или эмбриональной (Dnmt3b) летальности. Доказательства аналогичной роли у человека появились с открытием, согласно которому синдром ICF, редкое состояние, характеризующееся иммунодефицитом, центромерной нестабильностью и лицевыми аномалиями, связан с мутациями в гене, кодирующем Dnmt3b (Ehrlich, 2003). Анализ геномной ДНК лимфобластоидных клеток, взятых от больных ICF, показало пониженный уровень метилирования генома, особенно в повторяющихся последовательностях ДНК, ассоциированных с перицентромерными районами хромосом.