Картирование метилирования ДНК
Чтобы понять функции метилирования ДНК, необходимо сначала выяснить, где оно происходит в геноме. Для этого существуют несколько методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.
¦ Поскольку метилирование ограничено в основном последовательностями CpG, для картирования широко использовали расщепление рестрикционными ферментами, распознающими содержащие CpG нуклеотидные последовательности ДНК (Bird and Southern, 1978). Преимущество этого метода заключается в том, что можно протестировать большие участки генома, но он ограничен динуклеотидами CpG, которые обнаруживаются в сайтах рестрикционных ферментов.
¦ Надежный метод тестирования всех цитозинов в данном участке включает бисульфитную модификацию однонитевой ДНК (Frommer et al., 1992). Это приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов, но 5-метилцитозин остается защищенным. В результате цитозины, сохраняющиеся после обработки бисульфитом, идентифицируются как метилированные. Благодаря своей высокой разрешающей способности и позитивной идентификации метилированных цитозинов этот метод является предпочтительным для анализа паттернов метилирования ДНК, хотя детальный анализ больших участков занимает много времени.
¦ Несколько методов, базирующихся на ПЦР, которые зависят от предшествующей бисульфитной обработки, были разработаны для того, чтобы ускорить анализ интересующих исследователя районов (см., например, Herman et al., 1996). Эти методы очень удобны, но, фокусируясь на нескольких немногих сайтах CpG, они жертвуют детальной информацией, которая была бы получена при бисульфитном секвенировании.
¦ Недавно для картирования метилирования ДНК были использованы микрочипы (microarrays). Например, ДНК, устойчивая к деградации специфичной к 5-метилцитозину нуклеазой МсгВС, может быть использована как зонд для работы с последовательностями геномной ДНК методом tiled arrays, чтобы получить общую картину уровня метилирования в специфическом участке (Martienssen et al., 2005). Можно также провести иммунопреципитацию зондов для tiled arrays, используя специфичные к 5-метилцитозину антитела, что позволяет получить общую картину уровней метилирования ДНК (Weber et al., 2005).
2.5. Активное деметилирование зиготического отцовского генома
Помимо этих локальных изменений в метилировании ДНК имеет место значительное изменение уровней глобального метилирования ДНК в оплодотворенном яйце. Анализ уровней метилирования хромосомной ДНК с использованием анти-5-метилцитозиновых антител первоначально показал, что один хромосомный набор на ранних стадиях эмбрионального дробления удивительным образом дефектен в отношении метилирования ДНК (Rougier et al., 1998). Происхождение этого различия обнаружили, изучая зиготу до слияния материнского и отцовского пронуклеусов и используя для этого иммуноокрашивание 5-метилцитозина (Mayer et al., 2000). Вначале и материнский, и отцовский пронуклеусы демонстрировали равное окрашивание, что позволяло предполагать, что геномы яйцеклетки и спермия имели, грубо говоря, эквивалентные уровни метилирования цитозинов. Однако через несколько часов после оплодотворения наблюдали резкую утерю 5-метилцитозинов исключительно из отцовского генома. Бисульфитное секвенирование подтвердило, что один из двух геномов действительно деметилирован. Механизм утраты метилирования ДНК неизвестен, но он должен включать «активное» удаление этой модификации, поскольку в этот период нет никакой репликации ДНК. Интересно, что материнский геном тоже теряет метилирование ДНК в раннем эмбриогенезе, но в этом случае процесс является «пассивным» благодаря отсутствию поддерживающего метилирования ДНК во время ранних делений дробления. В целом предполагается, что в этот период удаляется более половины всего геномного метилирования. Затем, при имплантации происходит реметилирование, зависящее от Dnmt3a и Dnmt3b.
Об активном деметилировании ДНК сообщалось и в нескольких других случаях. Например, деметилирование промотора гена interleukin-2 в дифференцирующихся Т-хэлперных клетках (см. выше и: Bruniquel and Schwartz, 2003) происходит быстро и в отсутствие репликации ДНК. Сравнимый эффект был воспроизведен искусственно в системе ооцита лягушки, где сайленсированный, метилированный ген Oct-4 млекопитающего можно было транскрипционно реактивировать посредством процесса, зависящего от предшествующего деметилирования этого гена (Simonsson and Gurdon, 2004) Эта стадия, по-видимому, установлена для изоляции самой деметилазы.