Рис. 18.4. Островки CpG
Островки CpG — это участки высокой плотности CpG, лишенные метилирования CpG, обнаруживаемого на промоторах большинства генов человека Долговременный сайленсинг гена может быть обеспечен метилированием района островков CpG. Например, таким путем сайленсированы гены на неактивной Х-хромосоме и некоторые импринтированные гены. Кроме того, некоторые гены в раковых клетках аберрантно сайленсированы метилированием островков CpG
2.6. Что защищает островки CpG от метилирования ДНК?
Исследования паттернов метилирования ДНК оказались сфокусированными на вопросе о том, каким образом островки CpG у млекопитающих в норме остаются иммунными к метилированию ДНК, в остальном глобальному. Простейшее возможное объяснение заключается в том, что (1) островки CpG внутренне не способны к метилированию de novo метилтрансферазами ДНК, но это кажется невероятным, поскольку они становятся плотно метилированными на неактивной Х-хромосоме, тогда как островки на активной Х-хромосоме в той же клетке являются резистентными. Кроме того, в раковых клетках и клеточных линиях многие в норме неметилированные островки CpG поддаются метилированию. Поэтому были приняты во внимание несколько альтернативных (не обязательно взаимоисключающих!) объяснений паттерна метилирования ДНК у млекопитающих; (2) островки CpG защищены от метилирования связыванием факторов, каким-то образом исключающих Dnmt. Имеются доказательства, что связывающиеся факторы действительно исключают метилирование ДНК, но «футпринтинг» [footprinting, метод определения участков нуклеиновых кислот, образующих комплексы с белками] и тесты на чувствительность к нуклеазам показывают, что островки CpG (Lin et al., 2000) в ядре в высокой степени доступны; (3) островки CpG поддерживаются в свободном от метилирования состоянии с помощью ДНК-деметилаз, которые активно удаляют метил-CpG (Frank etal., 1991). Несмотря на несколько сообщений о деметилирующих активностях, все современные кандидатуры на роль ДНК-деметилаз не получили подтверждения. Однако этот сценарий нельзя исключить; (4) атипичный состав оснований и отсутствие метилирования отражают аномальный метаболизм ДНК в этих островках CpG. Например, имеются данные о том, что островки CpG являются ориджинами репликации [точками начала репликации], и на них>южет влиять структура интермедиата инициации репликации (Antequera and Bird, 1999). В качестве альтернативы можно предположить, что в этих сайтах может концентрироваться рекомбинация и (или) репарация, что приводит к высоким уровням обновления ДНК. Каким образом эти предполагаемые актвности могли бы исключать Dnmt — неясно. (5) Ранняя эмбриональная транскрипция с промотора островка CpG необходима для того, чтобы гарантировать, что метилирование ДНК исключено. В тестах с трансгенозом мутации промотора провоцируют метилирование островков CpG (Brandeis et al., 1994; MacLeod et al., 1994), и у ранних эмбрионов промоторы островков CpG в высокой степени тканеспецифичных генов обычно экспрессируются, но формальные доказательства того, что транскрипция исключает метилирование CpG, отсутствуют.
2.7. Переключается ли метилирование ДНК структурой хроматина?
Вышеописанные сценарии предполагают, что метилирование CpG является состоянием генома «по умолчанию» и что островки CpG поэтому возникают посредством исключения глобальной метилирующей активности. Недавно был предложен несколько иной взгляд: (6) паттерны метилирования ДНК определяются состоянием модификации лежащего в основе хроматина. В этом случае метилирование ДНК или его отсутствие включалось бы более ранним решением определенным образом модифицировать гистоновые белки. У гриба Neurospora crassa и растения Arabidopsis thaliana получены серъезные данные в пользу этой идеи (главы 6 и 9). Метилирование в этих системах не ограничено сайтами CpG и, как было показано, зависит от наличия метилирования гистона H3 по лизину 9 (H3K9me) (Tamaru and Selker, 2001; Jackson et al., 2002). У растений оказалось, что РНК-интерференция (RNAi) может служить «прицельным» механизмом для модификации хроматина, сайленсинга генов и метилирования ДНК (см.: Aufsatz et al., 2002; глава 8). Хотя у млекопитающих, у которых метилирование CpG преобладает, эти отношения были установлены хуже, отсутствие двух метилтрансфераз, метилирующих лизины гистонов (HKMTs) и специфичных к остаткам H3K9, как было показано, уменьшает метилирование CpG в повторяющихся последовательностях гетерохроматина (Lehnertz et al., 2003). Кроме того, было показано, что уменьшение содержания белка EZH2 из группы Polycomb (PcG), НКМТ, специфичной к остаткам H3K27, вызывает утрату метилирования CpG промоторов, являющихся мишенями для EZH2 (Vire et al., 2006). Имеются также убедительные данные о том, что у млекопитающих анти-смысловая транскрипция включает метилирование ДНК. Хиггс и сотрудники (Tufarelli et al., 2003) показали, что проведение [driving] антисмыслового транскрипта через ген ?-глобина в дифференцирующихся клетках мышиного эмбриона обеспечивает метилирование островков CpG-Механизм, лежащий в основе этого эффекта, остается неясным, но высказывались спекулятивные соображения, что здесь играет роль RNAi, подобно тому, что имеет место при некоторых событиях de novo метилирования у растений (Zilberman et al., 2003). Сообщалось о de novo метилировании, включаемом RNAi, в культивируемых клетках млекопитающих (Kawasaki and Taira, 2004), но современные данные заставляют считать, что этот феномен менее ясен, чем у растений или грибов