Несмотря на это концепция дифференциального функционирования материнского и отцовского геномов обретала почву, и было выдвинуто предположение, что «материнский геном мог бы быть в норме активным в хромосомном участке Hairpin-tail, в то время как его отцовский партнер преимущественно инактивирован» (McLaren, 1979). Важный шаг к установлению существования геномного импринтинга у млекопитающих был сделан несколькими годами позже с разработкой улучшенной технологии ядерных пересадок, с помощью которой тестировалась возможность получения диплоидных однородительских эмбрионов с использованием исключительно ядер из мышиных яйцеклеток. С помощью техники ядерных пересадок донорский мужской или женский пронуклеус извлекали из только что оплодотворенной яйцеклетки и тонкой микропипеткой переносили его внутрь оплодотворенной яйцеклетки хозяина, из которой был предварительно удален материнский или отцовский пронуклеус. Таким путем воссоздавались диплоидные эмбрионы, с той лишь разницей, что они обладали двумя материнскими или двумя отцовскими геномами (известные, соответственно, как гиногенетические и андрогенетические эмбрионы) (рис. 19.2). Эта техника была вначале использована для того, чтобы показать, что ядра от оплодотворенных мутантных эмбрионов Hairpin-tail нельзя было «спасти», пересадив их в хозяйскую яйцеклетку дикого типа. Это доказывало, что именно геном эмбриона, а не цитоплазма ооцита, несет дефект Hairpin-tail. Это также подтверждало предположение о том, что гены на материнской и отцовской копиях хромосомы 17 функционируют по-разному в ходе эмбрионального развития (McGrath and Solter, 1984b). Впоследствии ядерные пересадки были использованы, чтобы продемонстрировать, что эмбрионы, реконструированные из двух материнских пронуклеусов (известные как гиногенетические эмбрионы) или двух отцовских пронуклеусов (андрогенетические эмбрионы), были нежизнеспособными; только эмбрионы, реконструированные из одного материнского и одного отцовского пронуклеуса давали жизнеспособное и фертильное потомство (McGrath and Solter, 1984а; Surani et al., 1984). Эта работа опровергла предшествующее мнение, что однородительские мыши могут развиваться до взрослого состояния (Hoppe and Illmensee, 1982). Гиногинетические эмбрионы в момент гибели были дефектными по экстраэмбриональным тканям, которые входят в состав плаценты, а андрогенетические эмбрионы были дефектными по эмбриональным тканям Это привело к гипотезе о том, что для эмбрионального развития требуются импринтированные гены, экспрессируемые с материнского генома, тогда как отцовский геном экспрессирует импринтированные гены, необходимые для экстраэмбрионального развития (Barton et al., 1984). Последующая идентификация импринтированных генов у мыши не подтвердила такое смещение в функционировании импринтированных генов, показывая, что наблюдаемые различия между гиногенетическими и андрогенетическими эмбрионами можно объяснить доминантным эффектом одного или нескольких импринтированных генов.
Эксперименты с пересадкой ядер, в сочетании с подкрепляющими данными генетики мышей, дали убедительное доказательство того, что для эмбриогенеза у мышей требуются оба родительских генома, и заложили прочный фундамент для существования геномного импринтинга у млекопитающих (рис. 19.2). Широкий обзор вкладов родительских хромосом в эмбриональное развитие с использованием «транслокационных» мышей для создания UPD-хромосом (рис. 19.1) позволили идентифицировать у мыши два участка на хромосомах 2 и 11, которые демонстрировали противоположные фенотипы, когда присутствовали в виде двух материнских либо двух отцовских копий. Это еще более усилило доводы в пользу экспрессии специфичных в отношении родителя генов у млекопитающих (Cattanach and Kirk, 1985).
Рис. 19.2. Для репродукции млекопитающих нужны материнский и отцовский геномы
Техника ядерных пересадок использовала микропипетки и микроскопы с большим увеличением для удаления мужского или женского ядра из только что оплодотворенной яйцеклетки и введения их в разных комбинациях во вторую оплодотворенную яйцеклетку («хозяна»), которая уже была денуклеирована; тем самым создавались снова диплоидные эмбрионы с двумя материнскими (гиногенетические) или двумя отцовскими (андрогенетические) геномами или двуродительским геномом (дикий тип). Гиногенетические и андрогенетические эмбрионы были летальными на ранних эмбриональных стадиях. Лишь те реконструированные эмбрионы, которые получили и материнское, и отцовское ядро (дикий тип), выживали и давали живых мышат Эти эксперименты показывают, что при воспроизведении млекопитающих необходимы и материнский, и отцовский геномы и что эти два родительских генома экспрессируют разные наборы генов, нужных для полного эмбрионального развития