В противоположность увеличению эпигенетических модификаций в ДНК ICM, в ДНК в ТЕ, так же, как и в большинстве клеточных линий поздней плаценты, в основном остается гипометилированной (Chapman et al., 1984; Santos et al., 2002). Считается, что клетки плацентарного типа меньше нуждаются в эпигенетической стабильности, поскольку время их жизни более ограничено по сравнению с плодом, который развивается во взрослый организм.
Помимо этих крупномасштабных эпигенетических событий по всему геному, на этих стадиях также происходит репрограммирование более локус-специфическое. В женских эмбрионах XX на стадии дробления X хромосома, унаследованная от отца, инактивируется и в этом состоянии остается в экстраэмбриональных тканях, т. е. в ТЕ и плаценте (Huynh and Lee, 2003; Okamoto et al., 2005). Однако в ICM инактивированная X хромосома реактивируется, а затем после дифференцировки ICM в различные линии происходит случайная инактивация одной из X хромосом (Мак et al., 2004; более детально см. рис. 17.4). Механистически, импринтная X инактивация в преимплантационном эмбрионе связана с экспрессией некодирующей Xist РНК родительской хромосомы, чье «покрытие» хромосомы, как предполагают, приводит к сайленсингу генов и установлению репрессивных эпигенетических модификаций (Heard, 2004). Во вновь образующихся клетках ICM Xist транскрипция подавляется, репрессивные гистоновые модификации, в конце концов, утрачиваются, и хромосома реактивируется (Мак et al, 2004; Okato et al., 2004). Вскоре после этого происходит случайная X инактивация в клетках эпибласта. В следующем разделе мы покажем, что ES клетки «заморожены» на стадии реактивации X хромосомы и поэтому женские ES клетки содержат две активные X хромосомы.
4. От плюрипотентных клеток к соматическим клеткам и обратно к половым клеткам
4.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток
В предыдущей главе мы выяснили, что в зиготе, а затем на стадии дробления и в бластоцисте происходят важные эпигенетические события, в результате чего эпигенетический рисунок в ICM и ТЕ отличается Сейчас мы рассмотрим генетические и эпигенетические свойства культивируемых ранних стволовых клеток, полученных из бластоцисты и более поздних линий, таких как эмбриональные стволовые клетки (Smith, 2001), трофобластные стволовые клетки (TS) (Rossant, 2001), эндодермальные клетки (XEN) (Kunath et al., 2005), эмбриональные половые клетки (EG) (Matsui et al, 1992).
Общим для этих клеточных типов является то, что их можно изолировать из интактных эмбрионов и получить из них культуру при определенных условиях культивирования. Такие культуры можно поддерживать длительное время и в них отсутствуют признаки старения. С ними можно осуществлять генетические манипуляции, затем вводить в живые эмбрионы, где они участвуют в развитии разных линий.
Одним из наиболее важных открытий в эмбриологии млекопитающих в 1980-е годы было развитие методов получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ES) из ICM. ES-клетки, эксплантированные из мышиных бластоцист в культуры, могут поддерживаться длительное время, а затем снова вводиться с помощью микроинъекпий в бластоиисты. Они колонизируют все эмбриональные линии, формируя таким образом химеры (рис. 20.6; Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981). Наиболее удивительным оказалось то, что потомки ES клеток могут колонизировать линию половых клеток и давать нормальное потомство, которое целиком происходит из генотипа ES-клеток. Это, а также возможность генетической манипуляции с геномом ES клеток с помощью гомологичной рекомбинации (что приводит к генному нокауту) произвело революцию в генетике мыши и сделало мышь генетической моделью организма.
ES-клетки имеют сходные свойства с клетками IСМ/эпибласта, однако имеются и существенные различия, что указывает на то, что они являются «синтетическим» клеточным типом, который, вероятно, не существует в нормальном эмбрионе (по-видимому, это относится и к другим плюрипотентным клеткам) (Smith, 2001).
Рис. 20.6. Получение Es и Ts клеток из бластоцисты
ES-клетки получают из клеток внутренней массы (ICM) и они могут поддерживаться в культуре без дифференцировки. Культивируемые клетки могут подвергаться генетическому манипулированию. ES-клетки могут быть введены в бластоцисты и колонизировать все ткани эмбриона, в том числе линию половых клеток, за исключением трофобластных клеток плаценты. TS-клетки получают из клеток трофэктодермы бластоцисты и при введении их в бластоцисты они вносят вклад в развитие клеток плацентарного типа