3.2. Субъядерное перемещение генов иммуноглобулинов
Периферическое пространство ядра и перицентромерный гетерохроматин — это два главных репрессивных компартмента в ядре, которые важны для воспроизведения и для неактивного состояния генов в гематопоэтических клетках (Brown et al., 1997; Baxter et al., 2002). В зависимости от степени своей активности, гены перемещаются между этими репрессивными компартментами и центральными позициями в ядре, что облегчает транскрипцию генов. Интересно, что локусы IgHw Ig? «по умолчанию» расположены на периферии ядра во всех не-В клетках, включая некоммитированные лимфоидные прогениторы (Kosak et al., 2002). Таким образом, локус IgH заякорен через дистальные гены VH на периферии ядра и сориентирован проксимальным доменом IgH по направлению к центру ядра, что облегчает перестройки DH-JH в лимфоидных прогениторах (Fuxa et al., 2004). Начальный этап активации локуса IgH состоит из перемещения локусов IgH и Ig? с периферии ядра в более центральную позицию внутри ядра в начале развития В-клеток (Kosak et al., 2002). Эта субъядерная передислокация, по-видимому, облегчает открывание хроматина и транскрипцию, характерную для зародышевой линии, ведущих к проксимальным перестройкам VH-DJH. Косвенные доказательства предполагают, что EBF1 и Рах5 играют определенную роль в центральном перемешении локусов IgH и Ig?, соответственно (Fuxa et al., 2004; Sato et al., 2004).
Хотя в про-В-клетках обе аллели локусов IgH и Ig? перемещаются в центральные позиции ядра (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004) совместно, эти две аллели ведут себя по-разному после успешной рекомбинации V(D)J в зрелых В-клетках (Skok et al., 2001). Вслед за активацией В-клеток продуктивно реорганизованные аллели Ig остаются расположенными вдали от центромерных кластеров, усиливая, таким образом, их экспрессию (Skok et al., 2001). В то же время нефункциональные аллели IgH и Ig? после активации В-клеток перемещены в центромерный хроматин и таким образом засайленсированы там. Интересно, что центромерное рекрутирование нефункциональных локусов IgH и Ig? происходит через дистальный участок их гена V, что предполагает, что те же самые последовательности ДНК участвуют в рекрутировании «молчащих» локусов Ig либо на периферию ядра, либо в центромерный гетерохроматин (Roldan et al., 2005).
3.3. Сокращение локуса генов иммуноглобулина
Приблизительно 200 генов VH локуса IgH распространены по участку длиной более 2,4 миллионов пар нуклеотидов и могут быть разделены на 15 дистальных, центральных или проксимальных семейств генов VH в соответствии со сходством их последовательности и позицией относительно проксимальных сегментов DH. В не-В-лимфоидных клетках и лимфоидных прогениторах две аллели IgH присутствуют в удлиненной конформации на периферии ядра (Kosak et al., 2002). Напротив, в коммитированных про-В-клетках локус IgH подвергается сокращению, что сближает дистальные гены VH с перестроенным проксимальным доменом DJH, облегчая таким образом перестройки VH-DJH (рис. 21.7) (Kosak et al., 2002; Fuxa et al., 2004).
Локус Ig? с его примерно 140 генами VK также растягивается по участку длиной более 3 млн. о. и, таким образом, является таким же большим, как локус IgH. Так же, как и ген IgH в про-В-клетках, локус Ig? подвергается сокращению в малых пре-В- и незрелых В-клетках, демонстрируя, что оба локуса Ig в перестраивающихся клетках находятся в состоянии сокращения (Roldan et al., 2005). Более того, анализ с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами к дистальным, центральным и проксимальным генам показал, что выпетливание отдельных субдоменов Ig отвечает за протяженное сокращение локусов IgH и Ig? (рис. 21.7) (Roldan et al., 2005).
Дистальные перестройки VH-DJH не имеют места в про-В-клетках Рах5! (Nutt et al., 1997), несмотря на тот факт, что в гиперацетилированном состоянии хроматина гены VH доступны на всем протяжении кластера генов VH, включая наиболее дистальное семейство VHJ558 (Hessleinetal., 2003). Отсутствие перестроек дистального VH — D J коррелирует с отсутствием сокращения локуса IgH (рис. 21.7), которое, однако, может быть восстановлено посредством экспрессии ретровирусного Рах5 в про-В-клетках Рах5-/- (Fuxa et al., 2004). Следовательно, Рах5 — это ключевой регулятор сокращения локуса IgH в про-В-клетках. Метилтрансфераза гистонов Ezh2 предположительно также участвует в сокращении локуса IgH, так как условная активация Ezh2 в HSCs приводит к редукции дистальных перестроек VH- DJH, несмотря на полную доступность хроматина дистальных генов VH в про-В-клетках, дефектных по Ezh2 (Su et al., 2003). Интересно, что между Рах5 and Ezh2 не имеется генетической связи, несмотря на сходный фенотип IgH-перестройки соответствующих мутантных про-В-клеток (Fuxa et al., 2004). Поэтому, возможно, что Рах5 функционирует как сиквенс-специфичный фактор «нацеливания», чтобы рекрутировать Ezh2-содержащий репрессивный комплекс Polycomb 2 (PRC2) к избранным участкам на локусе IgH. Возникающее метилирование локального хроматина в гистоне H3 на лизине 27 (H3K27me3) может привлекать комплекс PRC1, чтобы индуцировать сжатие хроматина целевых участков (Francis et al., 2004; обсуждается в главе 11), приводя, таким образом, к выпетливанию и к сокращению локуса IgH. В качестве альтернативы сокращение локуса может не зависеть от модификации гистонов в ядре, но предпочтительнее требует метилирования лизина сигнальных белков цитоплазматическим Ezh2-содержащим метилтрансферазным комплексом, про который известно, что он регулирует полимеризацию актина путем присоединения к фактору обмена GTP/GDP, Vavl, (Su et al., 2005).