Рис. 21.7. Сокращение локуса тяжелой цепи иммуноглобулина в про-В-клетках
Локус IgH состоит из проксимального домена, содержащего следующие генные сегменты: разнообразия (diversity, D), соединительные (joining, J) и константные (constant, С), а также большой кластер вариабельных (variable, V) генов с ~200 генами V, расположенными на участке длиной более 2,4 млн. о. Локус IgH находится в растянутой конфигурации в про-В-клетках Pax5-/- или Ezh2-/-, что позволяет V(0)1-рекомбинации осуществиться только в проксимальном домене. В про-В-клетках дикого типа все гены VН участвуют в перестройках VН-DH благодаря сокращению локуса IgH путем выпетливания
Более того, пре-BCR сигнал ведет к быстрому перемещению нефункционирующей аллели IgH к репрессивным центромерным доменам (Roldan et al., 2005). Следовательно, утрата сокращения локуса и центромерное рекрутирование изменяют реорганизованную по типу DJH аллель IgH во время образования свободного от RAG окна пре-В-сигнала таким образом, что она не может более подвергаться перестройкам типа VH-DJH после последующей реэкспрессии белков RAG в малых пре-В-клетках (рис. 21.8).
Рис. 21.8. Аллельное исключение путем устранения сокращения локуса IgH в пре-В-клетках
В ранних про-В-клетках реорганизации типа DH-JH происходят одновременно в обеих аллелях IgH, тогда как в поздних про-В-клетках только одна аллель в это время подвергается рекомбинации по типу VH-DJH. Ядра рассортированных про-В- и пре-В-клеток были проанализированы трехмерным DNA-FISH с флуоресцентными зондами из дистального (красный) и проксимального (зеленый) участков локуса IgH. Две аллели IgH одной и той же клетки показаны на двух репрезентативных конфокальных срезах. Пре-BCR сигнал приводит не только к быстрой потере белка RAG, но и к устранению сокращения локуса IgH. Хотя обе аллели не находятся в состоянии сокращения, локус IgH полностью растянут только в случае не окончательно DJH-перестроенной аллели. Эти два сигнала функционально перестроенной аллели (VDJ+) разделены более коротким расстоянием благодаря делеиии внедренной последовательности ДНК. Данные по FISH взяты из Roldan et al. (2005)
Инициация аллельного исключения в локусе Ig? изучалась, в значительной степени, посредством исследования паттерна метилирования ДНК с помощью рестрикционных ферментов, чувствительных к метилу (Mostoslavsky et al., 1998; Goldmit et al., 2002;, 2005), и, наряду с этим, посредством анализа гетерозиготных по репортеру ?°-GFP мышей, содержащих вставку гена GFP в элементе J?1 эндогенного локуса Ig? (Liang et al., 2004). Локус Ig? сильно метилирован в динуклеотидах CpG во всех не-В и про-В-клетках, но становится специфически деметилирован только на одной аллели в пре-В-клетках (рис. 21.9) (Mostoslavsky et al., 1998; Liang et al., 2004). Это моноаллельное деметилирование предваряет перестройку и зависит от активности как интронных, так и 3’ к — энхансеров (Mostoslavsky et al., 1998). Эта деметилированная аллель находится в доступном хроматине, так как он чувствителен к ДНКазе I, гиперацетилирован по гистонам H3 и Н4 и расположен в пре-В-клетках вдали от центромерного хроматина (рис. 21.9) (Goldmit et al., 2002, 2005). Как следствие, только неметилированная аллель Ig? инициирует транскрипцию зародышевой линии и перестройки типа V?-J? (Goldmit et al., 2002; Liang et al., 2004), тогда как в малых пре-В-клетках обе аллели подвергаются сокращению локуса (рис. 21.9) (Roldan et al., 2005). На удивление, в пре-В-клетках вторая аллель Ig? перемещается в центромерный гетерохроматин (Goldmit et al., 2005), аналогично локусу IgH (Roldan et al., 2005).
Это моноаллельное центромерное рекрутирование (рис. 21.9) может объяснить, почему для аллели с метилированной ДНК характерно пониженное ацетилирование гистонов и почему она связана с белками НР1у и Ikaros, которыми наряду с комлексами деацетилазы гистонов обогащен центромерный хроматин (Goldmit et al., 2005). Интересно, что именно поздно реплицирующаяся аллель Ig? перемещается в центромерные кластеры (Goldmit et al., 2005) в соответствии с тем, что паттерн асинхронной репликации, уже установленный на ранних стадиях развития эмбриона, коррелирует с моноаллельной инициацией перестроек Ig? в пре-В-клетках (Mostoslavsky et al., 2001). Удивительно, что только очень малая доля (5 %) всех пре-В-клеток подвергается активации локуса Ig? у мышей ?°-GFP (Liang et al., 2004).
Рис. 21.9. Механизмы, контролирующие аллельное исключение в локусе Ig?
В пре-В-клетках субъядерное перемещение, деметилирование ДНК и ацетилирование гистонов вносят свой вклад в выбор одной аллели Ig? для VK-JK-рекомбинации. Для детального объяснения см. текст. Обозначены: дистальный участок VK (красный) и проксимальный домен JK-CK (зеленый) локуса IgK, и их расположение относительно репрессивного компартментов на периферии ядра (серый) и центромерным хроматином (синий). У этих двух аллелей состояния сокращения локуса, метилирования ДНК (me) и ацетилирования гистонов (ас) схематично показаны для разных стадий развития, включая активированные зрелые В-клетки