Пересадка ядер в ооциты выглядит совершенно иначе. Полностью выросшие ооциты, взятые из яичника самки, находятся в профазе первого мейоза (рис. 22.1). Ядра примерно 50 соматических клеток, инъецированные в ядро (зародышевый пузырек) этих растущих ооцитов, не реплицируют ДНК и не делятся, но на протяжении нескольких дней становятся все более активными в отношении транскрипции. Ооциты, получившие пересаженные ядра, культивируются подобно яйцеклеткам в непитательной солевой среде и не претерпевают никаких морфологических изменений на протяжении всего периода культивирования (две недели и больше).
Рис. 22.1. Схема, изображающая два типа экспериментов по трансплантации ядер у Xenopus
Верхняя часть рисунка иллюстрирует пересадки одиночных ядер в яйцеклетки, денуклеированные ультрафиолетовым облучением (УФ). Спустя три дня после пересадки ядра формируется плавающий головастик Нижняя часть рисунка показывает множественные пересадки ядер в растущие ооциты на стадии первой мейотической профазы (GV) Зародышевый пузырек, или ядро ооцита. Подвергшиеся инъекции ооциты не делятся и могут культивироваться в течение многих дней. Инъецированные ядра соматических клеток претерпевают изменения в экспрессии генов на протяжении первых четырех дней культивирования
2.2. Млекопитающие
Самые ранние попытки клонировать млекопитающих были выполнены с эмбрионами кроликов. В этих экспериментах ооциты сливали с клетками, взятыми от эмбрионов на стадии морулы, и было видно, что получающиеся в результате этого триплоидные клоны проделывали несколько делений дробления (Bromhall, 1975). В 1984 году МакГрат и Солтер применили слияние с помощью вируса Сендай для эффективной пересадки донорских ядер в денуклеированные зиготы. Этот метод был использован для экспериментов двух типов: (1) получают однородительские эмбрионы, замещая мужской пронуклеус женским (что дает начало гиногенетическому зародышу) или замещая женский пронуклеус мужским (что дает начало андрогенетическому эмбриону) (McGrath and Solter, 1984а,b; Suranietal., 1984). Однородительские эмбрионы не развиваются и неизменно погибают, давая первое доказательство того, что нормальное развитие млекопитающих критическим образом зависит от родительски-специфичного геномного импринтинга (2) Клонированные эмбрионы были получены путем пересадки ядер от эмбрионов-доноров, находящихся на стадии дробления, в денуклеированные зиготы. Ни один из таких реконструированных эмбрионов не развивался дальше поздней стадии дробления, из чего следует, что тотипотентность генома в ходе раннего развития быстро утрачивается и что клонирование млекопитающих, в противоположность амфибиям, может быть невозможным (McGrath and Solter, 1984b). Однако результаты, полученные на других видах млекопитающих, вскоре поставили этот вывод под сомнение.
В 1986 году Вилладсену (Willandsen) удалось клонировать живых ягнят из ядер 4—16-клеточного эмбриона и вскоре после этого последовало создание клонированных телят и свиней (Robi et al., 1987; Prather et al., 1989). Почему клонирование сельскохозяйственных животных оказалось успешным в противоположность хорошо контролируемым экспериментам по клонированию мышей (McGrath and Solter, 1984Ь)? Основное различие в развитии этих видов животных заключается в сроках перехода от материнского контроля развития (на основе запасенной матерью РНК) к зиготическому контролю развития (на основе зиготически продуцируемой РНК). Этот основной переход, по-видимому, происходит на 8—16-клеточной стадии у овец и крупного рогатого скота (Calarco and McLaren, 1976; Camous et al., 1986), но уже на 2-клеточной стадии у эмбрионов мышей (Bolton et al., 1984). Таким образом, у клонируемых эмбрионов овец или коров временные ограничения для активации донорского генома могут быть менее жесткими, чем у клонируемых эмбрионов мышей, где для того, чтобы происходило дробление, донорское ядро должно быть активировано вскоре после пересадки.