Первым успешным получением клонированных животных путем пересадки ядра соматической клетки, а не пересадки ядра из клеток-доноров эмбриона на стадии дробления, было получение овцы из культивируемых фибробластов донора (Campbell et al., 1996b). За этим вскоре последовало создание «Долли» из донорского ядра клетки молочной железы (Wilmut et al., 1997); «Долли» оказалась первым млекопитающим, клонированным из донорской клетки взрослого животного. С тех пор были клонированы всего 15 видов млекопитающих, в том числе мыши, козы, свиньи, коровы, кролики, крысы, кошки и собаки (обзор см. Campbell et al., 2005).
Процедура клонирования млекопитающего, как и клонирование амфибий, включает два этапа. В большинстве, если не во всех успешных экспериментах по пересадке ядра соматической клетки, донорские ядра переносились в денуклеированные ооциты ( в отличие от ранних опытов по клонированию мышей, где донорское ядро от эмбриона на стадии дробления вводилось в денуклеированную зиготу; McGrath and Solter, 1984). На первом этапе пипеткой удаляли метафазное веретено яйцеклетки-реципиента, вслед за чем в денуклеированное яйцо пересаживали донорское ядро. У большинства млекопитающих донорское ядро вводилось в яйцеклетку путем электрослияния с денуклеированным яйцом. У мышей яйцеклетки особенно легко повреждаются, и пересадка ядра у этого вида наиболее эффективна путем физического переноса донорского ядра в яйцо (Wakayama et al., 1998). Как изображено на рис. 22.2, донорское ядро вводится в денуклеированное яйцо с помошью пьезоэлемента, который облегчает проникновение через zona pellucida и цитоплазматическую мембрану (Wakayama et al., 1998). Клонированные бластоцисты либо имплантируются в матку псевдобеременной приемной матери, чтобы получить клонированных мышей, либо эксплантируются в тканевую культуры, чтобы получить эмбриональные стволовые клетки от пересадки ядра (NT-ES, nuclear transfer embryonic stem cells). Клетки NT-ES генетически идентичны донору и могут, следовательно, использоваться для «заказной» («customized») клеточной терапии, называемой также «терапевтическим клонированием» (см. ниже).
Рис. 22.2. Пересадка ядер у мышей с помощью микроинъекций
(а) Схематическое изображение процедуры ядерной пересадки. Когда бластоциста эксплантируется на облученные клетки-фидеры, внутренняя клеточная масса (ICM) дает начало клеткам ES. Будучи перенесенной в синхронизированную псевдобеременную самку, такая бластоциста может развиться в мышь. Наружные клетки бластоцисты — трофэктодерма (ТЕ) — дают начало экстра- эмбриональным тканям (плаценте), а клетки ICM генерируют эмбрион, (б) Те же этапы, что и на а, показаны с помощью световой микроскопии (воспроизведено, с любезного разрешения, из Meissner, 2006)
3. Фенотип клонированных животных
Получение животных путем пересадки донорских ядер соматических клеток не эффективно, и те редкие животные, которые доживают до взрослого состояния, часто обнаруживают множественные аномалии. В отличие от этого, когда в качестве доноров ядер используются эмбриональные клетки, выживаемость клонов и у амфибий, и у млекопитающих гораздо выше В следующей главе акцент делается на отношении между возрастом донорского ядра и его влиянием на выживаемость клона в сопоставлении с фенотипом клонов амфибий и млекопитающих, полученных из взрослых и эмбриональных донорских клеток.
3.1. Амфибии
Когда ядра бластулы трансплантируются в хорошего качества реципиентныеяйцаЛсяо/ж?, свыше 30 % таких яиц развиваются в нормальных головастиков, и большинство этих последних можно вырастить до стадии фертильных взрослых животных. По мере того как донорские клетки дифференцируются, степень нормальности развития трансплантантных эмбрионов снижается (рис. 22.3), не столь быстро в случае эндодермальных донорских ядер, как при использовании других. У амфибий оказались информативными серийные ядерные пересадки, в которых донорские ядра берутся из бластулы, которая сама была получена в результате пересадки ядра соматической клетки (рис. 22.4). Это делается потому, что клетки эмбриона от первой пересадки часто представляют собой мозаику клеток, нормальных и ненормальных по хромосомам, из-за различий в скорости репликации ДНК между соматической клеткой и активированным яйцом; серийные трансплантации ядер демонстрируют возможности развития у ядер эмбриона от первой пересадки, которые меньше повреждены ядерной пересадкой. Несколько нормальных половозрелых, генетически маркированных лягушек, самцов и самок, были получены даже при использовании кишечного эпителия питающихся личинок (Gurdon and Uehlinger, 1966). Этот результат показывал, что процесс дифференцировки не обязательно связан с утратой способности обеспечивать нормальное развитие, и, следовательно, принцип сохранения генома по мере дифференцировки клеток не нарушается.