Два других предположения могут помочь объяснить аномалии ядерных трансплантатов, которые возникают после начала зиготической транскрипции при переходе к средней бластуле. Первое связано с количественной нерегулярностью активации ранних зиготических генов (Byrne et al., 2003), а второе — с сохранением специфичной для донора экспрессии генов в некорректной зародышевой линии эмбрионов-трансплантатов (см. ниже). Однако не было показано, что эти отличия от нормальной экспрессии генов прямо отвечают за наблюдаемые аномалии развития.
Большие количества и крупные размеры яиц и ооцитов амфибий вдохновили исследователей на попытки понять молекулярные основы репрограммирования. Наиболее предпочтительным путем было получение бесклеточных экстрактов, с помощью которых можно было бы воспроизвести in vitro события, происходящие после пересадки ядер в живые яйцеклетки и ооциты. Последовательное обеднение этих экстрактов могло бы позволить идентифицировать необходимые компоненты. Этот подход оказался особенно успешным при идентификации компонентов яйцеклетки, инициирующих синтез ДНК. В особенности можно отметить идентификацию нуклеоплазмина (Laskey etal., 1978; Philpott et al., 1991), присутствующего в больших количествах компонента яйцеклетки Xenopus, который может деконденсировать спермий и стимулировать обмен гистоновых белков. Такие же процессы имеют место, когда соматические ядра добавляются в экстракты из яйцеклеток (Dimitrov and Wolffe, 1996; Tamada et al., 2006). Другие компоненты экстракта яйцеклеток, возможно вносящие вклад в процесс репрограммирования ядра, включают комплекс ремоделинга ISW1 (Kikyo et al., 2000) и белки зародышевой клетки ERGY2, функция которых — обратимая разборка ядрышек (Gonda et al, 2003). Было высказано предположение, что ремоделирующий комплекс BRG-1 может играть роль в яйцеклетках и у ранних эмбрионов путем пермеабилизации и ресилинга [by permeabilizing and resealing] ядер в экстрактах (Hansis et al., 2004). Эти опыты трудно интерпретировать, потому что пока еще не известно, чтобы бесклеточные экстракты были способны инициировать транскрипцию ядер. Поэтому лучшее, что можно сделать, — это воздействовать на ядра in vitro и затем пересадить их в живой ооцит, чтобы испытать на транскрипцию (Byrne et al., 2003; Tamada et al., 2006).
В настоящее время представляется, что для успешного репрограммирования ядер необходимы три этапа: (1) удаление эпигенетических меток на ДНК или белках, которые характеризуют данное дифференцированное состояние; (2) обеспечение транскрипционными факторами, необходимыми для тех генов, которые должны быть заново экспрессированы; и (3) деконденсация хроматина для того, чтобы транскрипционные факторы получили доступ к генам, на которые они действуют.
4.2. Млекопитающие
Последовательное эпигенетическое репрограммирование является важным аспектом нормального развития (Rideout et al., 2001). В ходе гаметогенеза на два родительских генома последовательно накладываются изменения метилирования ДНК, а также гистонов. После оплодотворения геном эмбриона модифицируется далее в ходе дробления и после имплантации. В табл. 22.3 дается сводка данных о некоторых эпигенетических отличиях клонированных животных от нормальных, которые возникают в результате ошибочного репрограммирования. Для последующего обсуждения мы подчеркиваем эти эпигенетические различия между эмбрионами, полученными в результате нормального оплодотворения и клонирования, на разных стадиях развития. Стадии развития, указанные в табл. 22.3 и обсуждаемые по порядку, — это (1) гаметогенез, (2) дробление, (3) постимплантация и (4) постнатальное развитие.
Наиболее важное эпигенетическое репрограммирование в нормальном развитии происходит во время гаметогенеза — процесса, который делает и геном спермия, и геном ооцита «эпигенетически компетентными» для последующего оплодотворения и для надежной активации генов, критичных для раннего развития (Latham et al., 1999). При клонировании этот процесс сокращается, и большинство проблем, затрагивающих «нормальность» клонированных животных, может быть связано с неадекватным репрограммированием соматического ядра после трансплантации в яйцеклетку. Поскольку плацента развивается из трофоэктодермальной линии, составляющей первый дифференцированный тип клеток эмбриона, можно было бы предположить, что у большинства клонированных животных репрограммирование и дифференцировка в эту раннюю клеточную линию нарушены. Действительно. как подытожено ниже, доля аномально экспрессируемых генов у клонированных новорожденных животных существенно выше в плаценте по сравнению с соматическими тканями.