Первая группа содержит те гены, которые участвуют в определении гиперметилирования промотора и сайленсинга генов, как одного из важных механизмов потери функции гена-супрессора опухоли при раковых заболеваниях (табл. 24.3). Эти гены уже были распознаны как классические гены-супрессоры опухоли, которые при мутации в зародышевой линии семьи вызывают наследуемые формы рака (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Они также часто мутируют при спорадических формах рака, но в таких опухолях они нередко могут быть гиперметилированы по одной или обеим аллелям (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Кроме того, для этих генов гиперметилирование промотора может иногда составлять «второй удар» (по гипотезе Кнудсона) в связи с тем, что они ассоциированы с потерей функции второй копии этого гена при семейных опухолях, где «первым ударом» является мутация в зародышевой линии (Grady et al., 2000; Esteller et al., 2001b). В некоторых случаях было показано, что индуцированная 5-азацитидином реактивация этих генов в культуре опухолевых клеток восстанавливает ключевую функцию гена-супрессора опухоли, утраченную в процессе роста опухоли. Таким примером является функция коррекции неправильного спаривания оснований ДНК в клетках рака толстой кишки, где имеет место сайленсинг гена MLH1 (Herman et al., 1998).
Вторая группа эпигенетически сайленсированных генов — это те гены, которые, благодаря их функции, ранее были идентифицированы как кандидатуры на роль генов-супрессоров опухоли, но для них не было показана сколько-нибудь существенная частота инактивации за счет мутаций. Эти гены могут рассматриваться как потенциальные супресоры, потому что они находятся в таких позициях на хромосомах, которые при раковых заболеваниях часто подвергаются делениям (табл. 24.3). Примерами являются RASFF1A и FHIT на хромосоме Зр при раке легких и опухолях других типов (Dammann et al., 2000; Burbee et al., 2001). Остальные гены — это те, про которые известно, что они кодируют белки, содействующие функциям, существенным для предотвращения роста опухоли, такие как ген проапоптоза, DAP-киназы (Katzenellenbogen et al., 1999).
Эти гены бросают вызов всей области эпигенетики рака, поскольку, несмотря на то, что при опухолях в них обнаружено частое гиперметилирование промотора должно быть специально доказано (поскольку многие из этих генов часто, если не всегда, мутируют) каким именно образом эти гены участвуют в генезе опухоли. Мы вернемся к этому вопросу в дальнейшем.
Третья группа генов идентифицируется по стратегиям, применяемым для случайной идентификации аберрантно сайленсированных генов, ассоциированных с гиперметилированием промотора (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). По сравнению с генами из второй группы, трудно поместить их в функциональный контекст развития рака, поскольку их функции могут быть совершенно неизвестны.
4.2. Поиск новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке
Чаще всего используемый подход при идентификации новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке, заключается в том, чтобы рассматривать в качестве кандидата любой потенциальный ген-супрессор опухоли, если мутации не обнаружены, или если экспрессия гена в изучаемых опухолях низкая, или вообще отсутствует. Другой используемый подход — это применить технику случайного скриннинга раковых геномов на гиперметилированные гены (Toyota et al., 1999; Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). Этот путь предоставляет огромные возможности для обогащения наших знаний в области биологии рака, но также вызывает много проблем. Как недавно было сказано в обзоре (Ushijima, 2005), каждый подход имеет свои сильные и слабые стороны.
Несколько подходов зависят от первого этапа, когда ДНК переваривается одним или несколькими рестрикционными ферментами, которые дифференциально расщепляют сайты CpG, в зависимости от того, метилированы ли они. Затем, чтобы определить потенциально гиперметилированные гены, продукты анализируют при помощи двухмерного электрофореза (Restriction Landmark Genomic Sequencing, RLGS), случайно амплифицируют, применяя случайные праймеры, или технику вычитания, чтобы дифференцировать метилированные последовательности нуклеотидов нормальной ДНК и ДНК из опухоли. Эти методы способны идентифицировать большое количество гиперметилированных генов, и каждый из них добавляет новые сведения относительно важных потенциальных кандидатов на роль генов-супрессоров опухоли. Однако идентифицированные последовательности нуклеотидов могут быть либо связаны, либо на связаны с островками CpG, которые стратегически расположены так, чтобы участвовать в сайленсинге генов. Повторяющиеся последовательности, которые часто бывают высокометилированными, иногда включены в конечные продукты. В результате, эффективность идентификации гиперметилированных генов-супрессоров опухоли часто бывает не очень высока и затруднительна в масштабах целого генома.