1. Обосновать метилирование промотора островка CpG и скоррелировать с транскрипционным сайленсингом гена и способностью отменять сайленсинг деметилирующими препаратами в культуре клеток
2. Обосновать корреляцию гиперметилирования промотора со специфичностью к этому изменению в раковых клетках (культура клеток и первичные опухоли) против аналогов среди нормальных клеток и случаев изменения гиперметилирования в первичных опухолях
3. Обосновать положение измененного метилирования для развития опухоли рака данного типа
4. Обосновать потенциальное значение генного сайленсинга при опухолеобразовании при помощи изучения реинсерции генов в культуре клеток и влияния на клонирование на мягком агаре, при росте опухолевых клеток в голых мышиных эксплантах и т.п.
5. Установить функцию белка, кодируемого сайленсным геном — либо через известные свойства либо путем тестирования активности узнаваемых белковых мотивов в культуре и т.п.
6. Обосновать супрессорную активность и функцию гена при обновлении клетки и т.п., особенно для совершенно неизвестных генов, посредством изучения нокаутных мышей.
5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака - значение для ранних стадий развития опухоли
Согласно классическому взгляду на развитие рака, сформулированному Фогелыитейном и его коллегами (Kinzler and Vogelstein, 1997), серия генетических изменений стимулирует продвижение от ранних предмалигнизованных стадий через появление инвазивного рака к началу метастазирующей стадии заболевания (рис. 24.4). Это развитие у разных опухолей не обязательно всегда осуществляется именно в таком порядке Мы знаем, что на всем протяжении такого хода событий, также имеют место эпигенетические изменения: наблюдается раннее появление как широко распространенных утрат нормального метилирования ДНК, так и его более локального прироста в промоторах генов, которые мы обсуждаем. Таким образом, имеется потенциальная возможность для взаимодействия эпигенетических и генетических событий, чтобы направлять последовательные клеточные аномалии на всем протяжении неопластической прогрессии. В соответствии с этим сценарием, данные, касающиеся двух эпигенетических аспектов — потери импринтинга (LOI — loss of imprinting) (как это обсуждалось в главе 23) и сайленсинга генов — оказываются крайне важными для ранних стадий развития рака.
Рис. 24.4. Ранняя роль аномального метилирования ДНК в развитии опухоли
Описано в класической модели (Kinzler and Vogelstein, 1997) генетических изменений в процессе эволюции рака толстой кишки. Показано, что измененное метилирование ДНК имеет место очень рано (красная стрелка), как сказано в тексте, во время превращения нормального эпителия в гиперпластический. Этот факт определяет его стратегическое положение (левая нижняя черная стрелка и левый нижний прямоугольник): стволовые клетки направляются на путь аномальной клональной экспансии (рис. 24.5) при содействии ключевых генетических изменений. Эти эпигенетические аномалии также имеют смысл маркеров, как показано в нижнем левом черном прямоугольнике. Аномальное метилирование ДНК продолжает накапливаться в процессе превращения опухолей из неинвазивных в инвазивные и, наконец, метастазирующие (правая нижняя стрелка и правый прямоугольник). Это создает дополнительную основу для лечения рака и для поисков маркеров, используемых в прогнозировании заболевания