Способ, которым вышеупомянутая траскрипционно активная организация хроматина промоторов, содержащих островки CpG, преобразуется в процессе развития опухоли, остается в основном неизвестным, расшифровка этого преобразования остается одной из главных проблем в области эпигенетики рака. Как было упомянуто ранее, аномально метилированные по ДНК островки CpG в промоторах генов, сопровождающиеся генным сайленсингом, часто обнаруживаются на самых ранних и предраковых стадиях развития опухоли, делая наше понимание лежащих в основе факторов потенциально очень важным для изучения биологии рака. Это также открывает новые возможности для выявления факторов риска при раке, для облегчения ранней диагностики рака и для выдвижения новых стратегий предупреждения и раннего вмешательства в канцерогенез.
Какой бы конкретный механизм, из тех, что будут рассматриваться далее в этом разделе, не был задействован. конечным результатом, проявляющимся в процессе развития опухоли, является «разлад» механизмов, которые охраняют участки островков CpG в генном промоторе от «вторжения» хроматина репрессивного типа, расположенного на 5’ и 3’ границах. Результатом является превращение конфигурации промотора из транскрипционно открытой в закрытую с более плотно упакованными нуклеосомами и потерей гиперчувствительных сайтов, а также появление множественных состояний деацетилирования и метилирования гистонов, характерных для транскрипционно репрессивного хроматина (рис. 24.6). Иерархия всех этих событий, в том смысле, которое из них является наиболее значимым в поддержке этой репрессии, все еще нуждается в определении. Однако одна важная черта, которая всплывает из анализа множественных генов, состоит в том, что какой бы ни была роль компоненты ДНК-метилирования в инициации и (или) поддержании генного сайленсинга, однажды состоявшись, она играет доминирующую роль в наследуемости транскрипционно-репрессивного состояния. Соответственно, такие терапевтические приемы как ингибирование активности HDAC специфическими лекарственными препаратами, не могут индуцировать реэкспрессию раковых генов, промоторы которых содержат в себе плотно метилированнные островки CpG Однако, если сначала применяется низкая доза такого деметилирующего агента, как 5’-деоксиазацитидин (DAC), то затем ингибиторы HDAC обнаруживают при реэкспрессии «молчащих» генов эффект аддитивности и(или) синнергизма (Cameron et al., 1999; Suzuki et al., 2002). Данная парадигма в сочетании с использованием микрочипов для поиска, реэкспрессии сайленсных базально генов доказала свою ценность даже для идентификации новых эпигенетически сайленсированных генов при раке (Suzuki et al., 2002). Аналогично этому, реэкспрессия генов, следующая за назначением DAC, может привести к устранению меток сайленсирующего метилирования гистонов из промоторных участков эпигенетически сайленсированых раковых генов (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo et al., 2003). В этом смысле, как показано на рис. 24.6, метилирование ДНК может служить «замком», чтобы стабилизировать эпигенетический сайленсинг раковых генов и обеспечить его стабильное наследование, приводящее к потере функции генов.
Еще один ключевой вопрос из области эпигенетического сайленсинга раковых генов касается того, какая из DNMT ответственна за установление и поддержание аномального метилирования ДНК промотора, которое часто сопровождает этот процесс. Современные данные позволяют предполагать, что эти этапы могут быть опосредованы каким-то другим способом, нежели это можно было бы предположить, исходя из классической роли Dnmt, установленной при исследовании развития мышей. При развитии мышей, как вытекает из исследований нокаутов трех известных биологически активных ДНК-метилтрансфераз — Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b — два последних фермента отвечают за установление метилирования (метилирование ДНК de novo), тогда как Dnmtl ответственна за дальнейшее поддержание установленных паттернов (поддерживающее метилирование ДНК) (Li et al., 1992; более детально см. главу 18). Однако в культуре клеток рака толстой кишки исследования по генетическому разрушению DNMTs показывают, что поддержание большинства случаев общего метилирования ДНК, в том числе гиперметилирование промоторов и сопровождающий его сайленсинг генов, требует наличия как DNMT1, так и DNMT3b (Rhee et al., 2000, 2002). Изучение раковых клеток других типов дали более разнообразные результаты — от указания на некоторую степень партнерства этих двух ферментов в таком поддержании до описания генов, которые деметилируются и транскрипционно реактивируются при уменьшении количества одной только DNMT1 (Leu et al., 2003). Таким образом, вопрос о том, как DNMTs устанавливают и поддерживают аномальные паттерны метилирования ДНК в раковых клетках, требует того, чтобы исследования были продолжены. Особенно мы нуждаемся в прояснении того, посредством каких комплексов эти ферменты могли бы кооперироваться и с помощью каких механизмов они нацеливаются на промоторы генов. Несколько последних исследований показывают, что для такого рекрутирования ключевыми являются комплексы транскрипционной репрессии (Di Croce et al., 2002; Fuks et al., 2003: Brenner et al., 2005) Каковы бы ни были эти механизмы, следует помнить, что в эксперименте DNMTs млекопитающих обладают сложными функциями, включающими не только каталитическую активность, связанную с карбокситерминальными участками в отношении метилирования ДНК, но и активность, непосредственно связанную с транскрипционной репрессией в аминотерминальных доменах (см. рис. 18.3) (Robertson et al., 2000; Rountree et al., 2000; Fuks et al., 2001). Эти ферменты также могут связываться с ключевыми медиаторами транскрипционной репрессии, в том числе с HDAC и с белками, связывающимися с метилцитозином (MBDs), и потенциально рекрутировать их. Таким образом, роль DNMT в транскрипционном сайленсинге потенциально имеет много граней (от инициации до поддерживания), которые могут включать этапы метилирования ДНК, а могут и не включать их. Сайленсинг генов при раке поможет рассортировать эти возможности.