3. Гетерохроматин у дрожжей находится в «молчащих» локусах типов спаривания НМ и теломерах
У дрожжей информация, детерминирующая типы спаривания (а или а), находится в трех локусах, НМ La, МАТ, и HMRa, III хромосомы. Локусы HMLα (~11 т.п.н. от левой теломеры) и HMRa (-23 т.п.н. от правой теломеры; рис. 4.36,в) расположены между короткими элементами ДНК, называемыми сайленсерами Е и I. Только когда любая из двух «молчащих» кассет копируется и интегрируется в активный локус МАТ, она приобретает способность транскрибироваться в нормальной клетке. Перенос информации из локуса HMLα в локус МАТ приводит к образованию клетки с типом спаривания α (МАТα), а перенос информации из локуса HMRa в локус МАТ — клетки типа а (МАТа) (рис. 4.36). Это показывает, что гены и промоторы в локусах ЯМ невредимы, но находятся в стабильно репрессированном состоянии до тех пор, пока остаются в этих локусах. Это — существенное для поддержания способности к скрещиванию обстоятельство, поскольку одновременная экспрессия в одной и той же клетке транскриптов обоих типов (а и α) приводит к возникновению не способного к скрещиванию стерильного состояния. Регистрация стерильного фенотипа оказалась весьма полезной для идентификации мутаций, нарушающих сайленсинг локусов НМ. Белки-регуляторы сайленсинга (silent information regulatory proteins — SIRs) SIR1, SIR2, SIR3 и SIR4 были обнаружены именно как необходимые для полной репрессии «молчащих» локусов НМ (см. обзор Rusche et al., 2003). Мутации sir2, sir3, и sir4 приводят к полной утрате сайленсинга, в то время как при мутациях sirl лишь часть клеток МАТа утрачивает способность к спариванию из-за нарушения репрессии локуса НМ. Благодаря частичному фенотипу sirl-дефектных клеток удалось показать, что альтернативные состояния (спаривающееся-неспаривающееся) могут наследоваться в последовательных поколениях делящихся генетически идентичных клеток (Pillus and Rine 1989). Это послужило ясной демонстрацией того, что репрессия типов спаривания обладает характерными чертами эпигенетически контролируемого процесса. Кроме того, в других исследованиях было показано, что в образовании структуры гетерохроматина участвуют N-концевые участки молекул гистонов H3 и Н4, белок-активатор репрессора 1 (repressor activator protein 1 - Rap1) и комплекс узнавания ориджинов репликации (origin recognition complex — ORC) (см. обзор Rusche et al., 2003).
Рис. 4.3. Переключение типов спаривания у дрожжей
(а) Гомоталлические штаммы дрожжей способны переключать тип спаривания с каждым клеточным циклом. Переключение происходит до репликации ДНК, поэтому и материнская, и дочерняя клетки приобретают новый тип спаривания.
(б) Показано положение «молчащего» и экспрессирующегося локусов типа спаривания на III хромосоме. Активный локус МАТ может переключаться посредством конверсии генов примерно один раз на каждый клеточный цикл, благодаря двунитчатым разрывам ДНК эндонуклеазой НО. Указанные проценты показывают частоту, с которой события конверсии переключают локусы МАТ между противоположными типами. Направленность переключения обеспечивается энхансером рекомбинации (RE) на левом плече III хромосомы.
(в) Репрессия «молчащих» локусов типов спаривания HMR и HML происходит под действием двух сайленсеров, фланкирующих эти гены. Они называются Е (от essential) и I (от important) (Brand et al., 1997) и содержат участки связывания белков Rap1 (R), Abf1 (А) и ORC (О). Комбинируя такие сайты связывания в разных комбинациях, можно создавать искусственные сайленсеры, хотя их эффективность ниже, чем у природных. НМLα и HMRa расположены на расстоянии 12 и 23 т.п.н. от теломеры III хромосомы, соответственно. Домены теломерного гетерохроматина III хромосомы репрессируются независимо от локусов НМ процессом, инициируемым множественными сайтами связывания Rap1 (R)
Гетерохроматин присутствует также непосредственно по соседству с повторами теломерной ДНК дрожжей (C1-3A/TG1-3). Как упоминалось выше, при интеграции репортерных генов, таких как Ura3 или Ade2, рядом с теломерными повторами происходит их репрессия по мозаичному и эпигенетическому типу (Gottschling et al. 1990) Этот эффект (ТРЕ), как и сайленсинг локусов НМ, зависит от Rap1, Sir2, Sir3, Sir4 и N-концевых участков молекул гистонов (Kayne et al., 1988; Aparicio et al., 1991). Генетические исследования свидетельствуют о том, что, за исключением Sir1, близкие механизмы обеспечивают сайленсинг в области локусов НМ и в примыкающих к теломерам участках. Более того, учитывая способность репортерных генов в субтеломерных участках достаточно часто переключаться между «молчащим» и экспрессирующимся состояниями, данный тип репрессии, по-видимому, весьма близок явлению мозаичности, обусловленной эффектом положения (PEV) у дрозофилы.