Рис. 4.5. Модель гетерохроматина дрожжей в теломерах и локусах НМ
Для распространения SIR-комплексов механизмы сайленсинга и теломер, и НМ-локусов используют Rap1, Sir2, Sir3 и Sir4, но они различаются тем, что теломерный зависит также от yKu, в то время как НМ-сайленсеры используют факторы ORC, Abf1 и Sir1. Предполагается, что теломерный гетерохроматин образует обратную петлю сам на себя. В результате получается структура, защищающая теломеру от деградации. Ее конденсация и сворачивание приводят к сайленсингу генов. В случае HM-гетерохроматина репрессированный домен между сайленсерными элементами состоит из тесно расположенных нуклеосом, образующих конденсированную структуру И теломерные, и НМ «молчащие» области недоступны аппарату транскрипции и деградирующим ферментам
Не столь ясен вопрос о степени гиперконденсации гетерохроматина у дрожжей и многоклеточных организмов, и обусловленного ею затруднения доступа факторов транскрипции к ДНК. Репрессивный комплекс, образующийся при взаимодействии белков Sir с гистонами, оказался неожиданно динамичным: эти белки могут включаться в хроматин «молчащего» локуса НМ даже при остановке клеток в фазе клеточного цикла, в которой образования гетерохроматина обычно не происходит (Cheng and Gartenberg, 2000). Возможно, именно этим обстоятельством объясняется способность Sir-содержащего хроматина связываться с определенными факторами транскрипции даже в репрессированном состоянии (Sekinger and Gross, 1999). Тем не менее, хотя эти исследования и свидетельствуют о том, что гетерохроматин не является механическим препятствием для связывания с ДНК всех негистоновых белков, в нем не обнаруживается транскрипционной активности и связанных РНК-полимераз. Судя по результатам экспериментов Чена и Видома (Chen and Widom, 2005), специфически подавляемым гетерохроматином процессом является связывание с промотором комплексов РНК-полимеразы II и транскрипционных факторов TFIIB и TFIIE. Итак, хотя «молчащий» хроматин дрожжей является динамичным образованием, допускающим обмен белков SIR и, возможно, некоторых факторов транскрипции, он избирательно препятствует связыванию основного аппарата транскрипции и тем самым блокирует синтез мРНК (более детально см. главу 10).
5. Отдельные этапы сборки гетерохроматина
Формирование гетерохроматина у всех видов включает несколько молекулярных этапов, некоторые из которых были найдены и у почкующихся дрожжей. Один из наиболее изученных из них — сайт-специфическая нуклеация гетерохроматина, требующая участия сайт-специфических ДНК-связывающих факторов. Затем гетерохроматин распространяется из сайтов инициации. Распространение ограничивается специальными пограничными механизмами, которые у дрожжей хорошо изучены. Наконец, дрожжи успешно использовали для демонстрации роли субъядерных компартментов в опосредованной гетерохроматином репрессии. Формирование гетерохроматина в области теломер несколько отличается от его формирования в локусах НМ, но в обоих случаях действует общий принцип, что специфические ДНК-связывающие факторы инициируют распространение репрессоров общего назначения. В деталях эти механизмы описаны ниже (рис. 4.6).
Рис. 4.6. Этапы сборки теломерного гетерохроматина
ЭТАП 1. Рекрутирование Sir4, затем Sir2 и Sir3 связанным с теломерами Rap1. Нателомерах Rap1 и yKuрекрутируют Sir4даже в отсутствии Sir2 и Sir3. Только Sir4 может быть рекрутирован в отсутствии остальных Sir-белков, причем его связыванию препятствуют Rifl и Rif2 (Mishra and Shore 1999).
ЭТАП 2. Опосредованное Sir2 деацетилирование гистона H4K16. Sir4-Sir2 и Sir4-Sir3 активно взаимодействуют, образуя Sir-комплексы по длине TG-повторов. НАД-зависимая гистон-деацетилазная активность Sir2 стимулируется образующимися комплексами и деанетилирует К16 остаток гистона Н4 в близлежащих нуклеосомах.
ЭТАП 3. Распространение SIR-комплекса по нуклеосомам. SIR-комплексы распространяются по нуклеосомам, возможно, с использованием О-ацетил-АДФ-рибозных интермедиатов, образующихся в результате НАД-гидролиза (Liou et al. 2005). Sir3 и Sir4 связываются с деацетилированными хвостами гистона Н4. Хотя деацетилированный N-концевой хвост гистона H3 также связывает белки Sir3 и Sir4, он не показан.