Наконец, было показано, что ограничению распространения «молчащих» доменов хроматина, помимо вышеописанного механизма, способствуют присутствие в эухроматине гистона H2A.Z и ассоциированного с РНК-полимеразой фактора Bdfl (Meneghini et al., 2003), метилирование гистона H3 по 79-му остатку лизина (van Leeuwen et al., 2002) и присоединение ДНК к ядерным порам (Ishii et al., 2002). И хотя механизмы действия этих факторов неизвестны, интересно отметить, что некоторые активные гены ассоциированы с ядерными порами (Ishii et al., 2002; Brickner and Walter, 2004). Итак, обшей чертой пограничных факторов у дрожжей может быть сильная стимулирующая транскрипцию или ремоделирующая нуклеосомы активность, которая прямо или опосредовано нарушает взаимодействие гистонов с белками гетерохроматина
9. Образование теломерных петель
Существует ряд данных, свидетельствующих о возможности образования петель по концам хромосом, в результате которого теломеры могут преодолевать пограничные элементы и стабилизировать репрессивную структуру хроматина в субтеломерных генах (рис. 4.5,4.6). Например, несмотря на то, что сайты связывания Rap1 присутствуют только в пределах первых 300 н.п. повторяющихся TG-богатых последовательностей ДНК на концах теломер, с помощью иммунопреципитации хроматина обнаружено присутствие Rap1 в нуклеосомах на расстоянии до ~3 т.п.н. от TG-повторов (Strahl-Bolsinger et al., 1997). Аналогично, yKu обнаружен на расстоянии ~3 т.п.н. от нормальных сайтов своего связывания на конце хромосомы (Martin et al., 1999). Более того, при нарушении сайленсинга мутациями генов SIR происходит потеря Rap1 и yKu во внутренних последовательностях при их полной сохранности в области концевых TG-повторов (Martin et al., 1999). Для объяснения распространения содержащего белки Rap1 и yKu гетерохроматина на расстояние около 3 т.п.н. даже в препаратах хроматина фрагментированного на куски <500 н.п. была предложена модель петлеобразования по концам хромосомы, в которой связанные с TG-повторами молекулы Rap1 и yKu взаимодействуют с SIR-белками более внутренних областей in trans (рис. 4.5, 4.6). Такая структура, возможно, участвует в реализации «кэпирующей» функции связанных с теломерой белков.
Результаты в пользу модели петлеобразования теломер были получены в работе де Брюна и соавторов (de Bruin et al., 2001), которые использовали неспособность таких активаторов транскрипции как Gal4 осуществлять свою функцию, когда они находятся ниже активируемого гена. Были сконструированы штаммы, в которых верхняя активирующая последовательность (upstream activating sequence — UAS) Gal4 помещалась ниже гена-репортера, и вся рекомбинантная конструкция вставлялась во внутренние локусы хромосом или вблизи теломеры. Оказалось, что во внутренних локусах эта конструкция не способна к галактозо-индуцибельной транскрипции, а в субтеломерных участках Gal4 UAS элемент может активировать промотор, расположенный в 1.9 т.п.н. выше, Sir3-зависимым механизмом. Вероятно, в присутствии Sir3 теломерный конец образует обратную петлю, позиционирующую Gal4 UAS в непосредственной близости от промотора активируемого гена (de Bruin et al., 2001).
10. Нарушение непрерывности репрессии естественных субтеломерных элементов теломерными петлями
Выше мы нарисовали упрощенную картину образования непрерывных участков «молчащего» хроматина, начинающихся с теломерных сайтов связывания белка Rap1. В действительности в природных теломерах все происходит более сложным образом в значительной степени из-за наличия пограничных элементов в области субтеломерных повторяющихся последовательностей. В большинстве экспериментов по включению в эту область репортерных конструкций для изучения теломерной репрессии субтеломерные повторяющиеся элементы X и Y’ удаляют. В результате репортерный ген оказывается непосредственно по соседству с TG-повторами. С другой стороны, все природные теломеры содержат субтеломерный повторяющийся элемент X, расположенный между TG-повторами и самым близким к теломере геном. Около 50—70% природных теломер содержат также не менее одной копии более длинного субтеломерного элемента У’ (рис. 4.8). И X, и У’ элементы содержат сайты связывания регуляторов транскрипции Tbf1 и Reb1, ограничивающие распространение «молчащего» хроматина (Fourel et al., 1999). Однако, X элементы содержат также каноническую последовательность ORC и сайты связывания Abf1, действующие противоположным образом. Они реинициируют или усиливают репрессию репортерных генов, находящихся с внутренней от них стороны. В результате сайленсинг в природных теломерах приобретает прерывистый характер, что отличает его от модели непрерывного распространения, изображенной на рис. 4.6. Для объяснения такого несовпадения Прайд и Луис (Pryde and Louis, 1999) также предложили модель петлеобразования в области теломеры, в которой область не репрессированного хроматина оказывается между двумя репрессированными доменами. Тем самым прерывистый характер «молчащих» доменов объяснялся без отказа от представлений о нуклеации и распространения гетерохроматина от TG-повторов.