При наличии мух, имеющих PEV-фенотип, довольно просто провести скрининг на доминантные мутации во втором сайте (индуцированные химическими мутагенами, вызывающими точечные мутации или мелкие инсерции/делеции), которые либо являются супрессорами PEV (обозначаются Supressor of variegation, Su [varj) и приводят к утрате сайленсинга, либо являются энхансерами PEV (обозначаются Enhancer of variegation, E[var]), приводящими к усилению сайленсинга (рис. 5.1). Изолировали и охарактеризовали около 30 модификаторов PEV, но на основе такого скрининга можно предсказать существование значительно большего числа кандидатов на эту роль. Там, где такой ген был клонирован, а его продукт охарактеризован, обычно обнаруживают хромосомный белок или модификатор хромосомного белка (см. ниже). Небольшая выборка этих локусов вызывает как гаплоаномальный, так и триплоаномальный фенотип; т.е. если одна копия гена приводит к супрессии PEV, три его копии приводят к усилению PEV. Идентификация таких локусов привела к предположению, что белковые продукты этих генов играют структурную роль в гетерохроматине и что распространение гетерохроматиновой упаковки может управляться дозой этих белков в стохастическом режиме (рис. 5.2) (Locke et al., 1988). Однако «распространение» является не простым линейным континуумом, а сложным процессом, который, вероятнее всего, зависит от организации ДНК в том районе, который сайленсирован (см. ниже).
Результаты, наблюдаемые по перестройкам хромосом, заставляют предполагать, что эухроматиновый ген, в результате транспозиции вставленный в гетерохроматиновый район, также будет обнаруживать мозаичный фенотип. Так оно и оказалось. Для этой цели можно подвергнуть генноинженным манипуляциям Р-элемент — ДНК-транспозон, обнаруживамый во многих природных линиях Drosophila. Природный P-элемент имеет на каждом конце особые инвертированные повторяющиеся последовательностиикодируетвсеголишьодинфермент— P-специфическую ДНК-транспозазу Репортерные конструкты, лишенные ДНК-транспозазы, но содержащие другие гены, представляющие интерес для исследователя, можно вставить в геном Drosophila в присутствии активной транспозазы путем их совместной инъекции в эмбрионы Drosophila. Мобильный элемент на основе Р (такой, как показано на рис. 5.3а), несущий управляемую hsp70 копию white, можно использовать в мухах, лишенных эндогенной копии white, чтобы идентифицировать домены гетерохроматина Когда P-элемент вставляется в эухроматин, муха имеет красные глаза. Когда же этот Р мобилизуется (путем встраивания в ген, кодирующий транспозазу), приблизительно 1 % выявляемых линий обнаруживают мозаичный фенотип глаз. Гибридизация in situ показывает, что в этих случаях P-элемент перескочил в перицентромерный гетерохроматин, теломеры или небольшую четвертую хромосому (Wallrath and Elgin, 1995). Эта идентификация гетерохроматиновых доменов согласуется с более ранними цитологическими исследованиями.
Рис. 5.2. Зависимые от дозы эффекты некоторых модификаторов PEV
Полагают, что модификаторы PEV, обнаруживающие зависимый от дозы эффект, являются структурными белками гетерохроматина. В то время как в присутствии двух копий гена-модификатора дикого типа наблюдается мозаичный фенотип (обнаруживаемый здесь репортерным геном white; средняя хромосома, средний глаз мухи), присутствие трех копий гена-модификатора дикого типа обычно обусловливает более экстенсивное формирование гетерохроматина, что приводит к усилению сайленсинга репортерного гена (нижняя хромосома, нижний глаз мухи). Наоборот, присутствие только одной копии гена-модификатора дикого типа обычно приводит к пониженному формированию гетерохроматина и к повышенной экспрессии репортерного гена (верхняя хромосома, верхний глаз мухи)
Использование таких P-элементов позволило сравнить упаковку одного и того же репортерного гена в гетерохроматиновом и эухроматиновом окружении. Гетерохроматин относительно устойчив к расщеплению нуклеазами, как неспецифическими (например, ДНКаза 1), так и специфическими (рестрикционные энзимы), и менее доступен для других экзогенных зондов, таких как метилтрансфераза dam. Анализ одного и того же трансгена hsp26 (маркированного фрагментом уникальной растительной ДНК, рис. 5.3а) в эухроматине и в перицентромерном гетерохроматине с использованием микрококковой нуклеазы (MNase) выявил сдвиг в сторону более упорядоченного расположения нуклеосом в гетерохроматине (рис. 5.36, в). Фрагменты, полученные путем расщепления ферментом MNase, четко определены, что позволяет предполагать наличие меньшей, чем обычно, мишени для MNase в линкерном районе. Упорядоченное расположение нуклеосом простирается на весь 5’-регуляторный район гена; этот сдвиг несомненно обусловливает наблюдаемую потерю 5’-гиперчувствительных (HS) сайтов (Sun et al., 2001). Действительно, хотя механизм сайленсинга понят еще не полностью, имеются многочисленные данные о транскрипционной репрессии сильно мозаичных генов, включая утрату связывания TFIID и других транскрипционных факторов (Cryderman et al., 1999b).