2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEV позволил идентифицировать хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков
PEV можно модифицировать различными факторами. Температура во время развития и количество гетерохроматина в геноме были первыми факторами, влияющими, как было показано, на степень мозаицизма. Как правило, повышение температуры во время развития (с 25 до 29°С) приводит к супрессии мозаицизма (утрате сайленсинга), тогда как более низкие температуры (например, 18°С) вызывают усиление мозаицизма (увеличение сайленсинга). Другие изменения в условиях культивирования, ускоряющие или замедляющие скорость развития, могут давать похожие эффекты. Сильная супрессия обнаруживается у мух, несущих дополнительную Y-хромосому (самки XXY и самцы XYY), тогда как у самцов без Y-хромосомы (Х0) обнаруживается значительное усиление. В целом дупликация гетерохроматинового материала подавляет, а делециии гетерохроматинового материала усиливают мозаицизм. Эти эффекты могут быть обусловлены титрованием фиксированного количества ключевых белков, необходимых для упаковки гетерохроматина. Первые мутации во втором сайте, супрессирующие или усиливающие PEV, были идентифицированы Шульцем (Schultz, 1950) и Споффордом (Spofford, 1967). В настоящее время приблизительно 150 генов предположительно рассматриваются как модификаторы локусов PEV.
Рис. 5.3. Гетерохроматин упакован в регулярный нуклеосомный порядок
Мобильный элемент (а), несущий маркированную копию гена теплового шока для исследования и hsp70-управляемую копию white в качестве визуального маркера, можно использовать для изучения одного и того же гена в разных хроматиновых доменах. Ядра эмбрионов Drosophila из линии, несущей этот трансген в эухроматиновом домене (39С-Х; красные глаза), и из линии, несущей тот же самый трансген в гетерохроматиновом домене (HS-2; мозаичный глаз), были переварены возрастающими количествами фермента MNase, ДНК очистили и разогнали в агарозном геле, а Саузерн-блот гибридизировали с зондом, уникальным для трансгена (б). Линкерные сайты, расщепленные MNase, отмечены стрелками, (в) Сравниваются денситограммы последней дорожки каждой пробы (сверху вниз — слева направо). В гетерохроматине можно видеть набор 9—10 нуклеосом (красная линия) по сравнению с 5—6 нуклеосомами в эухроматине (синяя линия), что показывает наличие более регулярного «шага» в первом случае, (г) Схематическое представление этих результатов (б, в — с любезного разрешения из Sun et al., 2001, с изменениями [©American Society for Microbiology])
Мутации Su(var) и E(var) идентифицируют гены, причинно связанные с началом сайленсинга гетерохроматиновых генов при PEV [with the onset of hetero-chromatic gene silencing in PEV]. Молекулярный анализ этих генов сыграл существенную роль в углублении понимания механизмов, приводящих к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов. В большинстве случаев модифицирующее влияние мутаций на PEV является доминантным, и гетерозиготы Su(var)/+ или E(var)/+ демонстрируют фенотип с подавленным или усиленным PEV (рис. 5.1). Эффективное выделение и детальный генетический анализ мутаций Su(var) и E(var) зависят от наличия подходящей для эксперимента PEV-перестройки. Хотя было описано большое число PEV-перестроек (Flybase, 2005), лишь немногими из них можно легко воспользоваться для эффективного генетического скрининга и изоляции доминантных мутаций-модификаторов. Одна из наиболее полезных для такой экспериментальной работы PEV-перестроек— In(1)wm4 (Muller 1930). Эта перестройка обусловливает мозаицизм по white — фенотип, легко различимый на глазах взрослых мух, как показано на рис.5.1. Пенетрантность мозаицизма по white у wm4 является 100 %-ной, так что каждая муха в исходном штамме [the starting stock] имеет глаза с белой пятнистостью. Инактивация гена white не влияет на жизнеспособность или фертильность, что обусловливает возможность неограниченной работы с мухами, гомозиготными по wm4.