(а) Политенные хромосомы, на фиксированных и давленых препаратах слюнных желез (микроскопия с фазовым контрастом, слева) «окрашены» с помощью инкубирования сначала с антителами, специфичными к данному хромосомному белку, а затем со вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой. НР1 (справа) и НР2 (в центре) имеют сходный рисунок распределения, демонстрирующий бросающуюся в глаза связь с перицентромерным гетерохроматином, маленькой четвертой хромосомой (врезка, стрелка) и небольшой группой сайтов в эухроматиновых плечах. Обратите внимание на то, что на эффективность любого антитела может влиять выбор протокола фиксации (см. Stephens et al. 2003). (б, в) Ассоциация НР1 и SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой. Мутации в Su(var)3-9 приводят к потере НР1 из перицентромерного гетерохроматина (но не четвертой хромосомы; см. текст) (б), тогда как мутации в Su(var)2-5 приводят к делокализации SU(VAR)3-9 (в) (из: Shatter et al. 2002, с изменениями)
4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина
Анализ SU(VAR)3-9 позволил идентифицировать ключевую функцию, необходимую для сайленсинга гетерохроматиновых генов (Tschiersch et al., 1994). Этот белок содержит домен SET, функционирующий как фермент в метилировании H3K9 гистонов. То, что этот белок является метилтрансферазой лизина гистонов (HKMT), «нацеленной» на H3K9, было впервые показано в ходе изучения гомологичного белка человека, SUV39H1 (Rea et al., 2000). У Drosophila SU(VAR)3-9 является главной, но не единственной HKMT H3K9 (Schotta et al., 2002; Ebert et al., 2004). SU(VAR)3-9 контролирует диметилирование H3K9в основной массе перицентромерного гетерохроматина, но не в четвертой хромосоме, теломерах или эухроматиновых сайтах. Триметилирование H3K9, которое у Drosophila наблюдется, главным образом, во внутреннем хромоцентре, также контролируется SU(VAR)3-9. Диметилирование этого внутреннего района не зависит от SU(VAR)3-9, как и монометилирование H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Ebert et al., 2004). HKMTs, ответственные за эти модификации, все еще неизвестны. Важное значение диметилирования H3K9 в сайленсинге гетерохроматиновых генов демонстрируется сильным зависящим от дозы влиянием SU(VAR)3-9 на PEV (обсуждается выше), атакже тем фактом, что супрессия сайленсинга генов мутациями Su(var)3-9 коррелирует с активностью их HKMT Ферментативно гиперактивная мутация Su(var)3-9 pth является сильным энхансером PEV и вызывает повышенное содержание H3K9me2 и H3K9me3 в хромоцентре, а также порождает заметные сигналы H3K9me2 во многих эухроматиновых сайтах (эктопический гетерохроматин). S-Аденозилметионин функционирует как донор метальной группы для всех этих реакций метилирования; следовательно, мутации в гене, кодирующем S-аденозилметионинсинтазу, Su(z)5, являются доминантными супрессорами PEV (Larsson et al., 1996).
Исследования с использованием генов Su(var) начали вскрывать последовательность молекулярных реакций, необходимых для установления гетерохроматиновых доменов. Связывание SU(VAR)3-9 в гетерохроматиновых нуклеотидных последовательностях зависит как от его хромодоменов, так от SET-доменов (Schotta et al., 2002). Как контролируется SU(VAR)3-9 — все еще неизвестно. Метилирование H3K9 белком SU(VAR)3-9 устанавливает сайты связывания для НР1. Хромодомен НР1 специфически связывается с H3K9me2 и H3K9me3 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Что SU(VAR)3-9 связывается с HP1, было показано двугибридными тестами на дрожжах [yeast two-hybrid tests] и иммунопреципитацией (Schotta et al., 2002). Район SU(VAR)3-9, аминотерминальный по отношению к его хромодомену взаимодействует с доменом «chromoshadow» НР1. Этот район SU(VAR)3-9 взаимодействует также с карбокситерминальным доменом SU(VAR)3-7. SU(VAR)3-7 взаимодействует в трех разных сайтах с доменом «chromoshadow» НР1 (Delattre et al., 2000). При таком паттерне взаимодействий можно предположить, что эти три белка — НР1, SU(VAR)3-7 и SU(VAR)3-9 — физически связаны в мультимерных белковых комплексах гетерохроматина.
Ассоциация SU(VAR)3-9 и НР1 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой (Schotta et al., 2002). SU(VAR)3-9 вызывает диметилирование H3K9, который специфически узнается хромодоменом НР1 (Bannister etal., 2001; Lachner etal., 2001). Следовательно, у личинок нуль-Su(var)3-9 связывание НР1 с перицентромерным гетерохроматином нарушено (см. рис. 5.4Ь). Это отражает специфическую активность НР1, который связывается с H3K9me2, но не с H3K9me1; SU(VAR)3-9 не затрагивает монометилирование (Ebert et al., 2004). Диметилирование H3K9 во внутреннем хромоцентре, четвертой хромосоме в теломерах и в эухроматиновых сайтах не зависит от SU(VAR)3-9, и, следовательно, в мутантных линиях НР1 продолжает обнаруживаться во всех этих сайтах. В клетках дикого типа SU(VAR)3-9 связывается с этими сайтами, но, по-видимому, неактивен; неизвестная HKMT контролирует метилирование H3K9 в этих районах.