В конце 1919 года имущество собора было передано организованной группе верующих, так называемой «двадцатке».
В 1921 - 1922 годах страна переживала тяжелое бедствие - голод в Поволжье. По просьбе населения голодавших районов Советское правительство издало декрет об изъятии церковных ценностей для закупки за границей хлеба. Духовенство ответило на этот гуманный документ призывом к борьбе против Советской власти. Патриарх Тихон выпустил воззвание, в котором писал: «Мы не можем одобрить изъятие из храмов, хотя бы через добровольные пожертвования, священных предметов, употребление коих не для богослужебных целей воспрещается канонами вселенской церкви и карается как святотатство». И здесь же воистину «гибко» замечал, раскрывая истинное положение дела: «Важно не то, что давать, а кому давать… Будьте же мудры, как змеи», - поучал Тихон, обращаясь к духовенству.
В Петрограде центром борьбы против декрета правительства стал Исаакиевский собор. 5 марта 1922 года, в «неделю православия», верующих созвали особыми листовками из всех районов юрода в собор на так называемое «торжество православия». После обедни в алтаре было созвано тайное совещание представителей духовенства. Митрополит Вениамин призвал всех присутствующих не отдавать церковные ценности, а настоятель Исаакиевского собора протоиерей Богоявленский полностью поддержал его. Был намечен конкретный план действий по укрытию ценностей, предусматривавший и вооруженное сопротивление. Во время изъятия ценностей церковники сделали попытку спровоцировать вооруженное выступление верующих. Чекистами было обнаружено в соборе оружие.
В результате работы комиссии 5 и 8 мая 1922 года в Исаакиевском соборе было изъято более 48 килограммов золота, 2 тонны 220 килограммов серебра и 796 драгоценных камней. Церковники, активно сопротивлявшиеся акту изъятия ценностей и допустившие антисоветские действия, были преданы суду.
В конце 1920-х годов в результате общего для всей страны отхода трудящихся от религии и церкви пустеет и Исаакиевский собор. Церковная «двадцатка», в ведении которой находился собор, не предпринимала никаких мер к тому, чтобы поддерживать здание в порядке и выполнять необходимые ремонтные работы. Управление уполномоченного Наркомпроса в Ленинграде, под наблюдением которого здание собора находилось с 1925 года, неоднократно отмечало его неудовлетворительное состояние: протечки, отсутствие вентиляции и отопления. Мозаичные и живописные произведения покрывались плесенью и разрушались, мраморная облицовка осыпалась. Бесхозяйственность, преступное отношение к памятнику архитектуры и искусства были недопустимы.
По просьбе трудящихся и ходатайству Наркомпроса в июне 1928 года Президиум ВЦИК СССР вынес решение о ликвидации религиозной общины в Исаакиевском соборе в городе Ленинграде и о предоставлении собора в исключительное пользование Главнауки в качестве музейного памятника.
Через три года в здании собора был открыт Государственный антирелигиозный музей. Так началась новая жизнь собора, превратившегося в один из крупнейших музеев страны.
Основная цель вновь созданного музея в первый период его деятельности заключалась в борьбе с религиозными пережитками в сознании людей и распространении основ научно-материалистического мировоззрения.
«…Массам необходимо дать самый разнообразный материал по атеистической пропаганде, знакомить их с фактами из самых различных областей жизни, подойти к ним и так и эдак для того, чтобы их заинтересовать, пробудить их от религиозного сна, встряхнуть их с самых различных сторон, самыми различными способами…», - писал В. И. Ленин.
Именно эту задачу и решал музей «Исаакиевский собор» на первом этапе своей деятельности. В экспозиции были широко представлены материалы из истории атеистического движения и антинародной, антисоветской деятельности духовенства, а также документы, разоблачавшие классовую сущность религии и всех видов и форм религиозных организаций в СССР.
Первая экспозиция с незначительными изменениями и дополнениями просуществовала до 1937 года.
На состоявшейся в марте 1937 года сессии Ленинградского музейного совета, посвященной Государственному антирелигиозному музею, было принято решение об изменении его профиля. С этого времени он стал носить историко-художественный характер. Изменение профиля музея было определено тем, что в начале 1932 года постановлением Президиума ВЦИК СССР в ведение Академии наук был передан Казанский собор для организации в нем Музея истории религии и атеизма.