Удачно выпутавшись из неприятной истории и опасаясь новых злоключений, художник спешно приступил к написанию большого полотна «Положение во гроб» (300x203) для Санта-Мария ин Валличелла или Кьеза Нуова (Новой церкви), ставшей лабораторией утверждающегося стиля барокко. Это была та самая церковь, где бездомный оборванец Микеланджело Меризи однажды свалился в голодном обмороке и где он чувствовал себя счастливцем, если удавалось вместе с другими бедолагами получить тарелку горячей похлёбки и кусок хлеба в трапезной братства преподобного Филиппа Нери.
Из густого непроницаемого мрака пещеры вырастает монументальная шестифигурная композиция. Благодаря эффекту обратной перспективы персонажи картины, стоящие на каменной плите, нависшей над пропастью могилы, максимально приближены к зрителю, который невольно становится участником происходящего. Луч слева высвечивает обнажённое тело мёртвого Христа с опрокинутой назад головой и безжизненно свесившейся рукой. Любимый ученик Иоанн удерживает на весу бездыханное тело спереди, а старец Никодим, напрягшись, держит ноги. Над ними возвышаются озарённые мягким светом три Марии — застывшая в безутешном горе постаревшая Дева Мария, чьи распростёртые длани намекают на Распятие, рядом Мария Магдалина с поникшей головой и узнаваемым профилем Лены, а справа Мария Клеопова с воздетыми к небу руками, словно указывающая на предстоящее Христово Воскресение. Эти воздетые вверх руки завершают диагональ композиции, начавшейся с руки Христа, безжизненно повисшей над бездной.
Здесь отчётливо видно стремление автора к монументальной пластичности фигур в духе Микеланджело при написании картины, исполненной трагической патетики. Неслучайно её называют «классическим интермеццо», как дань великому наследию Возрождения. Высказывается предположение, что в образе фарисея Никодима, ученика Христа, приходившего к нему тайно, ночью (Ин. 3:1–2), художник запечатлел Микеланджело. Если это так, то моделью наверняка послужило изображение Микеланджело в образе философа Гераклита на фреске Рафаэля «Афинская школа» или изваяние «Пьета», на котором, по утверждению Вазари, великий мастер изобразил себя в образе старца Никодима. О новаторстве стиля художника говорят интенсивность красок на фоне густых непроницаемых теней и резкие контрасты светотени, усиливающие драматизм сцены. В картине поражают верность натуре и реалистический показ отдельных деталей. Например, натруженность ног старика Никодима с вздувшимися венами или же упирающийся прямо в зрителя угол тяжёлой каменной плиты. Выбранная автором точка зрения «снизу вверх» придаёт особую величественность и монументальность образам. Создаётся даже впечатление, что стоящие перед картиной зрители находятся на дне склепа, из которого пробился отросток тиса, препятствующего гниению, о чём было сказано выше, и им надлежит принять из рук Иоанна и Никодима тело Христа.
Трагическое «Положение во гроб» — это реквием возвышенной скорби по той неосознанной пока живущими на земле людьми великой жертве, которая была принесена Христом ради их спасения. Картина не оставила равнодушными даже противников художника. Бальоне и Беллори сочли её лучшим творением Караваджо. Никому из его современников не под силу было сотворить что-либо подобное. Даже известные картины Рафаэля и Тициана на тот же сюжет уступают творению Караваджо по силе эмоционального воздействия. С картины снимали копии крупнейшие мастера различных эпох — от Рубенса до Сезанна.
Несмотря на шумный успех, спустя некоторое время «Положение во гроб» было отвергнуто церковниками, которых смутили и напугали трагедийность звучания картины и жизненная достоверность персонажей. Её постигла та же участь, что и первый вариант «Святого Матфея» и обе доски для церкви Санта-Мария дель Пополо. К счастью для Караваджо, об этом он так ничего и не узнал, поскольку картину вынесли и упрятали в подвал, когда он уже покинул Рим. Она была извлечена на свет после более чем двухвекового заточения и оказалась в созданной в 1908 году Пинакотеке Ватикана. В 1608 году место отвергнутой картины в Кьеза Нуова занял триптих работы молодого Рубенса.