Всё внимание на картине сосредоточено на фигуре убийцы и лежащем на полу апостоле, осознавшем свою предстоящую смерть за веру. Люди, присутствующие в церкви, отпрянули в ужасе. Кое-кто схватился за шпагу, но, оцепенев от страха, не осмелился вмешаться и прийти на помощь священнику. На заднем плане в глубине среди перепуганных прихожан Караваджо дал собственное изображение — мужчина в чёрном камзоле, наблюдающий за происходящим со страдальческим выражением лица. У него вид человека, незадолго до этого события пережившего глубокое нервное потрясение. Это, пожалуй, один из самых проникновенных автопортретов, выражающий подлинную сущность художника. В пронзительном взгляде читается столько боли и сострадания, которые не были так отчётливо зримы ранее в его работах. Эти чувства стали проявляться с особой выразительностью и глубиной после потрясшей его казни Джордано Бруно.
На переднем плане изображены полуобнажённые калеки, пришедшие на службу в надежде на исцеление, так как апостол Матфей считался целителем душ и плоти. Один из несчастных в страхе торопливо отползает в сторону, чуть ли не касаясь руками рамы картины. Ракурсы калек настолько приближены к зрителю, что возникает иллюзия их физической ощутимости.
Но особенно впечатляет справа фигура мальчика-служки, который с криком бежит из церкви. Его облик напоминает такого же римского мальчугана из предсмертного творения Рафаэля «Преображение». Разница только в том, что у Рафаэля на картине мальчишка, изображённый также справа, кричит от восторга при виде свершившегося чуда, которого не узрел никто из взрослых, занятых привычными земными суетными заботами, а у Караваджо — это крик ужаса, вызванный зверским убийством в храме, на глазах у всех.
Однажды зайдя в церковь, автор невольно стал очевидцем неожиданной сцены, когда одна из прихожанок, потрясённая увиденным, закричала в ужасе: «Убийца!» — вторя мальчику-служке на картине, и выбежала вон из церкви. Этот крик на картине Караваджо отозвался в Риме мощным эхом, возвещая о рождении нового искусства, одинаково понятного и трогающего души как искушённых ценителей, так и простых людей.
Художник превзошёл самого себя, живописуя своими излюбленными средствами — тенью и светом — исполненную драматического накала картину, построенную на резких контрастах. Густые плотные мазки его кисти кажутся неподвижными и безвоздушными, чем создаётся особый напряжённый колористический настрой картины. Чередование светлых и тёмных пятен порождает иллюзию скольжения луча света по сгрудившимся фигурам и предметам. Кисть художника выхватывает из мрака отдельные лица в фас и профиль, руки, спины, некоторые детали в виде зажжённой свечи на алтаре или страусовых перьев на шлеме молодого воина слева, оставляя в темноте как несущественное всё остальное. Глубина перспективы утопает в тёмном безвоздушном пространстве. Еле различимы отдельные элементы архитектуры в виде тонущих во мраке колонн храма. Зато ярко освещены ступени перед алтарём, где разыгралась трагедия. По воле заказчика Караваджо был вынужден внести элемент условности в сугубо реалистическую картину, изобразив дымчатое облако с выразительной фигурой прилетевшего ангела, который протягивает поверженному Матфею пальмовую ветвь как символ его мученичества за веру. Это единственная уступка официальной ортодоксальности. Пожалуй, до Караваджо в итальянской живописи не было ещё столь впечатляющих и структурообразующих светотеневых контрастов, придающих подлинный драматизм происходящему, за исключением упоминавшейся выше работы Тициана «Убиение святого Петра Мученика», которая погибла в Венеции при пожаре.
Вторая картина цикла вызвала такой же живой интерес римлян, не успевших ещё опомниться после жестокой казни на площади Кампо ди Фьори. Им был понятен драматический пафос нового произведения. В отличие от спокойного «Призвания апостола Матфея» здесь с особой наглядностью и глубиной проявился дух нового динамичного искусства барокко, которое повсеместно прокладывало себе путь. Слава о двух шедеврах в церкви Сан-Луиджи шла по всему городу. Поэтому заказчик торопил с завершением работы. Воодушевлённый успехом Караваджо приступил к написанию последней картины цикла «Апостол Матфей и ангел» (223x183).