Градина в кралския дворец. Нощ. Дон Карлос с трепет очаква срещата, насрочена му тайно от непознато лице. Идва дама със забулено лице. Карлос я мисли за Елизабет, и пламенно й заговаря за любовта си. С рязко движение дамата сваля своя воал. Оказва се, че това е Еболи. Влюбената в Карлос принцеса е изпратила анонимната бележка. Инфантът грубо отблъсва Еболи. В сърцето на влюбената жена избухва пламъкът на отмъщението.
Неочаквано пристига Родриго. Той веднага разбира какво се е случило и заплашва Еболи, че ще я сполети нещастие, ако издаде приятеля му. Изпълнена с омраза, Еболи си отива. Родриго моли Карлос да му предаде всички писма, които е получил от кралицата, за да не го издадат.
Площад с издигната клада. На нея ще бъдат изгорени осъдените на смърт еретици. Придворните са заели местата си, народът е изпълнил площада. Идва Великия инквизитор, а след него и крал Филип със свитата си. Пред краля застават няколко фламандски депутати, водени от Дон Карлос. Те искат от Филип да помилва осъдените. Кралят изгонва делегацията. Тогава Карлос изважда шпагата си, той е готов да воюва за свободата на осъдените. Кралят заповядва да го обезоръжат, но никой не смее да се доближи до престолонаследника. Маркиз Поза, виждайки опасността, заплашваща приятеля му, го принуждава да предаде своята шпага. Дон Карлос е поразен от постъпката на Родриго, когото той е смятал за свой най-добър приятел.
Кабинет на крал Филип. Принцеса Еболи е изпълнила заканата си. Тя е откраднала от кралицата кутията с писмата на Карлос и я е предала на Филип. Кралят не е на себе си. Той искрено обича Елизабет и не може да се примири с нейната изневяра. Идва Великия инквизитор. Филип го пита как да постъпи с непокорния си син. Жестокият инквизитор предлага да бъде наказан със смърт като еретик заедно с маркиз Поза. Филип обаче вярва в Поза и отказва да последва съвета. Тогава старецът заплашва краля с вечно проклятие и разгневен напуска кабинета. Идва Елизабет. Кралят и показва кутията с писмата й и заповядва да я отвори. Елизабет отказва. Филип сам отваря кутията и в присъствието на Еболи и маркиз Поза с обидни упреци се нахвърля върху нея. Елизабет загубва съзнание. Еболи горчиво съжалява за станалото и когато кралицата идва на себе си, й признава, че тя е виновна за всичко. За наказание Елизабет изпраща Еболи в манастир.
В затвора. Дон Карлос не може да забрави предателството на своя приятел. Неочаквано вратата се отваря и в затвора влиза маркиз Поза. Отначало Дон Карлос не желае да го изслуша, но скоро разбира истината. Родриго е дошъл при него не по своя воля. Той е затворен, защото е заявил, че не Дон Карлос, а сам той е вожд на въстаналите фламандци. Край решетката минава монах. Изстрел поваля Родриго — кралят е наредил да бъде изпълнена присъдата. Преди да умре, Поза моли Дон Карлос да доведе докрай започнатото дело. Идва Филип, за да освободи сина си. В затвора нахлува разбунтувалият се народ, но Великия инквизитор успява да накара всички да се преклонят пред краля.
Кът в двореца Ескориал. Елизабет очаква Дон Карлос, който ще дойде, за да се прости завинаги с нея. Инфантът заминава за Фландрия. Двамата са заварени от крал Филип. Когато отново вижда сина си при Елизабет, обхванат or страшен гняв, той го предава на инквизицията. За да не попадне в ръцете на палачите, Дон Карлос се самоубива.
МУЗИКА
Операта „Дон Карлос“ е едно от най-високите постижения от втория период на творчеството на Верди. Това е силна музикална драма, чието въздействие завладява слушателя изцяло. Мнозина поставят музиката на „Дон Карлос“ над „Аида“. Съществува сполучливо сравнение на „Дон Карлос“ с най-хубавите табла на Веласкес — по сгъстеност на чувствата. Дълбокият драматизъм на Шилеровата трагедия е отразен с не по-малка сила в музиката на операта.
Верди често и извънредно сполучливо използува похвата на силните контрасти, внезапните смени на настроението, сблъсъци на светли и радостни чувства с мрачни и тежки мисли. В „Дои Карлос“ обаче композиторът не прилага този изпитан сценично — драматургичен метод. В тази опера той се стреми към единство на настроението в цялото произведение, като напрежението се повишава непрекъснато. По отношение на формата Верди също не се придържа към операта с рязко разграничени музикални номера. Отделните арии, дуети и ансамбли съществуват в „Дон Карлос“, но те се преливат едни в други с широко развити свързващи епизоди.
В почти всички свои опери от втория период на творчеството си Верди използува „лайттемата“. Това му помага да постига по-голямо единство в музикалния израз. В „Дон Карлос“ композиторът е вложил повече такива главни теми, а не само една, както в по-предишните си произведения. Това са: темата на „клетвата за вярност“, която прозвучава на много места и винаги при срещите на Карлос с маркиз Поза; темата на „любовта“, появила се още в дуета на Карлос и Елизабет в първата картина; темата на „страданието“ — тя има по-обединяващо значение и се долавя при трагични преживявания на различните герои — и положителни, и отрицателни. Трябва обаче да се изтъкне, че най-ярка и силна и с най-голямо значение за развитието на действието е темата на „клетвата за вярност“.