Его шуту никогда не удавалось развеселить его, и чувство юмора, которое у него когда-то было, окончательно его покинуло. Его состояние усугублялось отвращением к каким бы то ни было физическим упражнениям, он всегда оставался флегматичным и никогда не интересовался мужскими видами спорта, разве что теннисом и шахматами, но теперь он отказывался предпринимать даже короткие прогулки и выезды из Праги, хотя посещение отдаленных провинций его обширной империи было политически разумно и умерило бы недовольство его подданных. Он жил в своем ограниченном мирке, не делая ничего для управления подвластным ему обществом, никак не отвечая на появление в нем врагов и недоброжелателей, и все естественные события проходили стороной от его интересов. Он на педели и месяцы откладывал решения государственных проблем, требовавших незамедлительных действий, всё реже посещал своих министров, и, хотя положение обязывало его быть человеком публичным и интересоваться делами общественными, проводил всё время в алхимических штудиях, в занятиях ботаникой и астрологией, а также занимаясь вырезанием деревянных фигур и мебели, рисуя картины маслом и граня драгоценные камни.
Рудольф жил в плену собственных предрассудков, будучи жертвой суеверного страха смерти, который отчасти был следствием пророчества, сделанного Тихо Браге. И император, и его астроном были глубоко потрясены убийством во Франции Генриха III в 1589 г., совершенным монахом Жаком Клементом, сочтя, что подобная судьба ждет и Рудольфа.
В начале XVII в. агрессия воинственных и ненавидящих христиан турок на границах с Венгрией, вкупе с гражданскими и политическими беспорядками в Богемии, сильно пошатнула власть короны, но в то же время никак не уменьшила равнодушия Рудольфа к его императорским обязанностям. Он не вспоминал о том, что
Он передал военные полномочия в борьбе с магометанами своему брату Матиасу, которого австрийские герцоги подговорили заставить Рудольфа отречься от трона и занять его место. Считая, что инициаторами этого неудавшегося замысла были протестанты, Рудольф предпринял против них суровые меры, однако в это время в Венгрии вспыхнул мятеж. Все эти бедствия заставили Богемскую ассамблею лишить Рудольфа власти в апреле 1611 г. и короновать его брата Матиаса. Незадолго до своего отречения Рудольф, как говорит легенда, посмотрел из окна своего замка на Градчанах на Прагу и проклял Вечный город: «Прага, неблагодарная Прага! Тебя вознес я столь высоко, но ты отвергла своего благодетеля! Так пусть проклятие и гнев Божий падут на тебя и на всю Богемию!»
Лишенному власти монарху, слабому телесно и душевно, было позволено остаться в Праге и назначено содержание в 400 000 флоринов, не считая продовольствия. В начале 1612 г. его любимый ручной лев Оттакар заболел и умер, и Рудольф расценил это событие как роковое предзнаменование, поскольку много лет назад Тихо Браге заявил, что лев и император подвержены влиянию одних и тех же астральных знамений. Рудольф умер 20 января 1612 г., и знать решила держать его смерть в секрете, пока его брат Матиас не прибудет в столицу. Каспар Руки фон Рутц, один из слуг и алхимиков императора, с которым тот познакомился в Медицинской академии, пользуясь случаем, украл весь порошок для проекций и всё алхимическое золото, которое только смог унести с собой, обыскав королевские лаборатории и кунсткамеру. Имя вора тотчас стало известно первому министру, и алхимик с несколькими соучастниками был арестован и заточен в темницу.
После страшных пыток на дыбе Руки повесился в своей камере на веревке, которую обычно обматывал вокруг запястья, нося на ней ключи от своего кабинета. Его тело было отдано палачу, который отвез его на место свершения суда — площадь в центре Градчан, где тело алхимика было разрублено на части, кисти и ступни отрезаны, а язык и сердце вырваны. После этого изуродованные останки были сожжены и похоронены. Несмотря на эту публичную «казнь», люди, жившие в окрестностях замка, многие годы спустя утверждали, что дух алхимика всё еще бродит среди построек. Поговаривали, что он восседает верхом на козле, и сопровождают его шесть котов. Чтобы искоренить эти слухи, могилу вскрыли и сожгли то, что осталось от тела, повторно.
Со смертью Рудольфа наступили тяжелые времена и для некоторых других придворных, многие были арестованы по политическим соображениям, среди них — антиквары Рошель и Ганс Хайден, библиотекарь Хасталь, а также художник Иоганн Курбах, который был крещеным евреем. Помимо этого опять был временно заточен и изобретатель вечного двигателя Корнелиус Дреббель.