Рэли более не снаряжал экспедиции в Вирджинию. Патент, полученный от королевы, он передал в 1589 г. группе коммерсантов, которые, однако, не воспользовались им. В 1602 г. патент попал в руки более энергичных людей, которые с 1606 г. Начали колонизацию Вирджинии. Новые поселенцы узнали, что большинство людей, оставленных Уайтом, было убито, некоторым, правда, удалось спастись; они бежали на материк, где жили в мире и согласии с индейцами. Сообщали, что в живых осталось семь англичан — четверо мужчин, двое мальчиков и одна девочка, — но их никто никогда не видел.
Вторая половина 80-х годов XVI в. знаменовала собой быстрое нарастание враждебности в отношениях между Англией и Испанией. Дело явно шло к войне.
Филипп II, потеряв надежду убрать с английского престола Елизавету после провала заговоров против нее и казни Марии Стюарт в конце 1587 г., готовился к прямому нападению на Англию, создавая невиданный по размерам флот. Во всех портах Испании и Италии кипела работа: строились корабли, свозилось вооружение и продовольствие, сосредоточивались войска. В Англии упорно говорили о прибытии гигантской испанской эскадры уже летом 1587 г.
Елизавета, все время старавшаяся избежать военного конфликта с Испанией, под давлением «военной партии», которую возглавлял государственный секретарь Уолсингем, дала согласив на экспедицию Дрейка к берегам Испании. Дрейк, разгромив испанский флот в Кадисе в апреле 1587 г., сорвал нападение на Британские острова. Но всем — и в Испании, и в Англии — было ясно, что это лишь временная отсрочка.
Как ни увлечен был Рэли осуществлением планов английской колонизации Америки, он, понимая, что в англо-испанских отношениях наметился острейший кризис, со всем пылом включился в подготовку к войне с Испанией. В 1587 г. Рэли передал королеве построенный лишь за год до этого превосходный по своим мореходным и боевым качествам корабль «Ковчег Рэли», переименовав его в «Королевский ковчег». Этот корабль стал флагманским судном королевского военно-морского флота.
В ноябре 1587 г. Рэли был назначен членом военного совета, ответственного за подготовку к отражению возможного нападения испанского флота на Англию. Рэли отвечал за оборону побережья в районе Девоншира и полуострова Корнуолл, но его неукротимая энергия не знала границ. Он укреплял прибрежные города, расставлял наблюдательные посты, готовые дать сигнал о приближении врага, создавал местные вооруженные отряды. Так, он добился, чтобы жители Корнуолла выставили 5 тысяч солдат, дали 1,5 тысячи ядер, 700 лат, 2 тысячи алебард, 1,5 тысячи луков, 100 лошадей. Но ни сам Рэли, ни его солдаты в боях с испанцами практически не участвовали.
Испанский флот — «Непобедимая армада» — прошел мимо юго-западных берегов Англии, не высадив десанта. 23—27 июля произошло морское сражение в районе Портленда, а 28-го — у Кале. Испанский флот понес поражение. Непрерывно преследуемый английскими кораблями, он прошел вдоль французских берегов, повернул на север к Шотландии, миновав которую взял курс к родным берегам.
Возвращение в Испанию было поистине ужасным. Люди были истощены до предела. Запасы продовольствия и воды кончались. Штормы и туманы разбросали корабли. Десятки судов разбились о скалы у шотландских и голландских берегов. В сентябре 1588 г., когда корабли бывшей «Непобедимой армады» начали прибывать в испанские порты, стали известны размеры потерь. Из 134 судов эскадры вернулось не более 50. Из 26 тысяч солдат и матросов погибло не менее 20 тысяч. Потери английского флота были незначительны. Не был потоплен ни один корабль, число убитых не превышало 100 человек.
Разгром «Непобедимой армады» вызвал большое оживление приватирства в Англии. Рэли, который уже несколько лет посылал свои суда в пиратские экспедиции, не замедлил присоединиться к намечавшемуся весьма крупному делу: готовилось нападение непосредственно на испанскую территорию. В середине сентября 1588 г. Фрэнсис Дрейк и Джон Норрис, прославленный солдат, ветеран войнц против герцога Пармы в Нидерландах, передали королеве план операции по захвату Лиссабона. Рэли не только выделил для экспедиции один из своих кораблей, но и сам принял в ней участие.