Идею единства Руси, уже созревшую к этому времени, стали воплощать в жизнь одновременно тверские и московские князья. Первым титул великого князя всея Руси принял Михаил Ярославич Тверской, который в начале XIV в. пытался подчинить себе оба Новгорода — Великий и Нижний, Кострому, Переславль. Его примеру последовал и Иван Калита — внук Александра Невского, глава сравнительно молодого и небольшого московского княжества, домогаясь этого титула и претендуя тем самым на главенство над всеми землями Северо-Восточной Руси. Борьба между ними велась и в ставке хана, который давал русским князьям «ярлык» (жалованную грамоту) на право занятия великокняжеского владимирского престола. Иван Калита воспользовался антиордынским восстанием в Твери 1327 г., выступив при его подавлении пособником хана. В награду за подавление Тверского восстания Иван Калита получил ярлык на великое княжение владимирское и право сбора ордынской дани, которое обеспечило великокняжескую казну дополнительными средствами. Это позволило Ивану Даниловичу (по прозвищу Калита, что значит «кошель») расширить территорию Московского княжества с помощью «купель», санкционированных Ордой. Так были присоединены к Московскому Галицкое и Угличское княжества. Переход в руки московских князей (носивших великокняжеский титул «владимирских») права сбора дани привел к сокращению сферы деятельности баскаков, временному прекращению ордынских набегов, что способствовало подъему экономики страны.
Упрочение внутреннего положения Северо-Восточной Руси к третьей четверти XIV в. сделало возможным первые военные успехи в борьбе с Ордой, переживавшей двадцатилетний период усобиц. В ходе их беклярибеку (главному ханскому военачальнику) Мамаю удалось объединить всю территорию западнее Волги вплоть до Днепра. Орда Мамая стала в 70-е годы наиболее сильным политическим образованием в пределах Джучиева улуса и главным противником Руси. В 1374 г. Мамай предпринял поход на Рязань, затем — в 1376 г. за Оку, в 1377 г. — на Булгар. 12 августа 1377 г. объединенная русская рать была разбита Мамаевой ордой на реке Пьяне. В 70-е годы активную антиордынскую позицию заняла русская православная церковь. Идейным вдохновителем борьбы с Мамаем выступил настоятель Троице-Сергиева монастыря под Москвой, благословивший князя Дмитрия Ивановича (1359—1390) на эту борьбу, Сергий Радонежский. 11 августа 1378 г. русским удалось нанести поражение ордынским войскам во главе с Бегичем на реке Воже. Этот успех удалось закрепить лишь через два года в Куликовской битве. Борьба с ордой была задержана московско-тверскими междоусобицами (1371—1372 гг.) и вмешательством литовского князя Ольгерда на стороне Твери. В результате похода объединенного войска московского и верхнеокских князей, ставших подданными Дмитрия Ивановича, последнему в 1375 г. удалось добиться капитуляции тверского князя, его отказа от претензий на великое княжение владимирское и признания им московского князя «братом старейшим». В это время ясно выразилась тенденция поддержки московских князей горожанами: их противодействие Михаилу Александровичу Тверскому в 1371 и 1375 гг. сыграло свою роль в победе Москвы над Тверью. С конца 70-х годов авторитет Московского княжества усилился, так как оно стало организатором и центром борьбы с Ордой, что закрепило его превосходство над Тверью.
8 сентября 1380 г. произошло победное сражение русских войск под руководством московского князя Дмитрия, прозванного за эту победу «Донским». Само сражение в источниках XIV в. было названо Мамаевым побоищем, а Н.М. Карамзиным в начале XIX в. — Куликовской битвой. Для современников важен был факт, что битва произошла на Дону, верховья которого в то время не принадлежали к русским владениям, и князю Дмитрию нужно было немалое мужество, чтобы, покинув русские пределы, принять открытый бой с противником на контролируемой им территории, о чем подробно повествует созданное 100 лет спустя после битвы «Сказание о Мамаевом побоище». Наиболее же достоверные сведения о битве содержат почти современные битве летописи, а отдельные детали — поэтическая песня-плач «Задонщина».
Целью похода Мамая было восстановление зависимости Руси от Орды в том объеме, который был характерен для середины XIV в. и от которого отказался Дмитрий Донской: уплаты ордынского «выхода», в том числе и с церкви. Требования эти были неприемлемы для усилившейся Руси, столкновение стало неизбежным. Получив известие о походе Мамая в конце июля-августе, князь Дмитрий направил войска в Коломну, ключевую крепость на Оке, а затем к Лопасне. В русское войско, насчитывавшее по косвенным данным около 10 тыс. человек, входили отряды из Москвы, Владимира, Белоозера, Серпухова, Тарусы и других верхнеокских городов. Оно переправилось через Оку навстречу Мамаю, ожидавшему на правом берегу Дона обещанной помощи литовского князя Ягайлы. Местом кровопролитной битвы, где русское войско встретилось с равной по силе ратью ордынцев и подвластных Мамаю народов, стал левый берег реки Непрядвы, правого притока Верхнего Дона. Здесь в соответствии с военной тактикой того времени русские войска построились в две линии: впереди сторожевой полк во главе с Дмитрием, а в глубине — большой (главный), с полками «левой и правой руки» (на флангах), в лесу выше по Дону расположился засадный полк. Сражению, согласно «Сказанию о Мамаевом побоище», предшествовал поединок богатырей — слуги Троице-Сергиева монастыря Пересвета и ордынского воина Темир-мурзы (Челубея). Основной удар войско Мамая нанесло в центр русских войск и сначала потеснило их, создав угрозу большому полку. Тогда-то решающую роль сыграл засадный полк, состоявший из отборной конницы. Возглавлявшие его воеводы Дмитрий Боброк и князь Владимир Андреевич Серпуховской бросили в тыл ордынской конницы свои войска и привели ее в замешательство, она начала отступать. Большой полк «левой руки» завершил разгром мамаева войска, обратившегося в паническое бегство.