Если зародыши на двух сопоставляемых стадиях роста имеют одинаковые изоакцепторные тРНК для данной аминокислоты, то их профили, меченные разными изотопами, должны совпасть. Если же эти тРНК различаются числом или характером своей «миноризации», то профили должны разойтись.
Из девяти сопоставленных таким образом тРНК для двух стадий развития зародыша пять не обнаружили никаких различий — их профили точно совпадали. А для четырех тРНК наблюдалось явное расхождение профилей и даже различие в их числе. Что означало различие числа изоакцепторных, «работающих» тРНК на двух сопоставляемых стадиях роста. Наверное, не случайно для всех этих четырех аминокислот генетический код оказался сильно избыточным. В четверку вошли все три аминокислоты, которым соответствует по 6 кодонов, и одна, имеющая 4 кодона.
Эти результаты также свидетельствовали в пользу нашей гипотезы. Но и они еще не доказывали ее правильности.
Описанный этап длился тоже два года: 75-й и 76-й.
3-й этап. Решающий эксперимент
План был таков. Очистить от тРНК и аминокислот клеточный сок из 6-часовой стадии развития. В нем должны остаться все ферменты и информационные РНК, присутствующие на этой стадии. Далее осуществить два опыта. В первом из них к этой очищенной системе добавить полный набор 20-ти аминокислот, из которых хотя бы одна (все равно какая) была бы радиоактивно меченая, а также суммарную фракцию тРНК, очищенную из той же 6-часовой стадии развития зародыша. Провести синтез in vitro радиоактивно меченных белков (одной меченой аминокислоты для этого достаточно).
Во втором опыте проделать то же самое, но суммарную фракцию тРНК очистить из 12-часовой стадии и провести in vitro синтез радиоактивных белков в тех же условиях. В обоих случаях отобрать белковые фракции, куда войдут и новосинтезированные, радиоактивно меченные белки. Затем разделить их методом электрофореза в тождественных условиях — в параллельных «дорожках» на одной и той же пластине геля. Если во втором случае по сравнению с первым обнаружатся дополнительные белки, то это означает, что их синтез был стимулирован именно «поздним» набором тРНК. Ведь информационные РНК в обоих опытах одни и те же, взятые из 6-часовой стадии роста.
Для постановки этих опытов было необходимо, во-первых, найти и оптимизировать условия осуществления синтеза полноценных белков in vitro в описанных выше условиях. Во-вторых, освоить и оптимизировать для наших объектов метод электрофореза в геле, позволяющий разделять большое число белков. В-третьих, отработать оптимальные условия регистрации полученного разделения белков на рентгеновской пленке. Все это заняло около двух лет. Наконец, все методики были отработаны и «решающий эксперимент» поставлен и повторен. Были получены четкие, воспроизводимые картины электрофореза белков, синтезированных in vitro для двух сопоставляемых условий эксперимента, отличающихся только использованными комплектами тРНК — из 6-часовой и из 12-часовой стадий развития зародыша вьюна. На рентгеновской пленке были ясно видны две соседствующие дорожки. В каждой из них зафиксировано порядка ста полос, отвечающих отдельным радиоактивно меченным белкам.
Но... при самом тщательном визуальном сопоставлении наборов этих полос различия между ними обнаружить не удалось!! Значило ли это, что гипотезу о регуляторной роли тРНК следует отвергнуть? Нет, не значило! Новые белки могли появиться в очень малых количествах. На фоне множества «изначально необходимых» белков, синтезируемых на всех стадиях роста, их, может быть, и невозможно обнаружить. Окончательный вывод можно сделать, только убрав до электрофореза из смеси белков, синтезированных с помощью тРНК из 12-часовой стадии, все «необходимые» белки, синтезируемые уже на 6-часовой стадии роста. По-видимому, единственный путь для решения этой проблемы лежал через использование иммунохимического подхода!