Строительство предсерийного Ту-144 завершилось в начале 1971 года, 1 июня 1971 года самолет совершил первый полет. По программе заводских испытаний машина выполнила 231 полет, продолжительностью 338 часов, из них 55 часов самолет летал на сверхзвуке. На этой машине отрабатывались комплексные вопросы взаимодействия силовой установки и самолета на различных режимах полета. 20 сентября 1972 года машина совершила перелет по трассе Москва — Ташкент, маршрут при этом был пройден за 1 час 50 минут, крейсерская скорость во время полета достигала 2500 км/ч. Предсерийная машина стала основой для развертывания серийного производства на Воронежском авиационном заводе, которому решением правительства было поручено освоение в серии Ту-144.
Первый полет серийного Ту-144 с двигателями НК-144А состоялся 20 марта 1972 года. В серии, по результатам испытаний предсерийной машины, была откорректирована аэродинамика крыла и еще раз несколько увеличена его площадь. Взлетная масса в серии достигла 195 тонн. Удельный расход топлива НК-144А к моменту эксплуатационных испытаний серийных машин намеревались довести за счет оптимизации сопла двигателя до 1,65–1,67 кг/кгс*ч, а в дальнейшем до 1,57 кг/кгс*ч, при этом дальность полета должна была увеличиться до 4550 километров.
Первая серийная машина 3 июня 1973 года во время демонстрационного полета в Ле-Бурже потерпела катастрофу. Погиб экипаж во главе с заслуженным летчиком-испытателем СССР, Героем Советского Союза М. В. Козловым (вместе с ним в этом полете погибли второй пилот В. М. Молчанов, заместитель главного конструктор В. Н. Бендеров, бортинженер А. И. Дралин, штурман Г. Н. Баженов, инженер Б. А. Первухин). Для расследования катастрофы была создана комиссия, в которой принимали участие специалисты СССР и Франции. По результатам расследования французы отмечали, что отказа в технической части советского самолета не было. Причиной катастрофы, возможно, явилось внезапное появление истребителя «Мираж III» прямо по курсу набиравшего высоту Ту-144, заставившее М. В. Козлова делать недопустимо резкий маневр, и, возможно, ряд трагичных случайностей на борту самолета, приведших к катастрофе.
Пожалуй, наиболее точно о той катастрофе в Ле-Бурже сказал известный летчик-испытатель, Герой Советского Союза Э. В. Елян: «Эта катастрофа — горький пример того, как стечение мелких, на первый взгляд, незначительных небрежностей, в данном случае и со стороны французских служб управления полетами, привело к трагическим последствиям».
Андрей Николаевич Туполев до этой громкой, вошедшей в статьи, учебники, справочники и беллетристические произведения катастрофы уже не дожил.
В первый пассажирский рейс Ту-144 отправился 1 ноября 1977 года. Полеты на расстояние 3260 километров проходили на высоте 16–17 тысяч метров со скоростью 2000 км/ч и проводились раз в неделю, количество пассажиров на борту не превышало 80 человек. До момента прекращения регулярной эксплуатации самолета для пассажирских перевозок, в мае 1978 года, экипажи «Аэрофлота» на Ту-144 выполнили 55 рейсов, перевезя 3284 пассажира. Полеты совершали летчики гражданской авиации, в присутствии инструкторов из туполевского ОКБ. Инструкторами на Ту-144 летали известные летчики-испытатели Э. В. Елян, И. К. Ведерников и другие.
Иван Корнеевич Ведерников говорил, что от полетов на Ту-144 он, как летчик, получал настоящее удовольствие, настолько стабильно и устойчиво вела себя машина в полете.