10 февраля 1909 года Великая княгиня собрала 17 сестер основанной ею обители, сняла траурное платье, облачилась в монашеское одеяние и сказала: «Я оставлю блестящий мир, где я занимала блестящее положение, но вместе со всеми вами я восхожу в более великий мир — в мир бедных и страдающих».
День в Марфо-Мариинской обители начинался в 6 часов утра. После общего утреннего молитвенного правила. В больничном храме Великая княгиня давала послушания сестрам на предстоящий день. Свободные от послушания оставались в храме, где начиналась Божественная Литургия. Дневная трапеза проходила с чтением «Жития Святых». В 5 часов вечера в церкви служили вечерню с утреней, где присутствовали все свободные от послушания сестры. Под праздники и воскресение совершалось всенощное бдение. В 9 часов вечера в больничном храме читалось вечернее правило, после него все сестры, получив благословение настоятельницы, расходились по кельям. Четыре раза в неделю за вечерней читались акафисты: в воскресенье — Спасителю, в понедельник — архангелу Михаилу и всем Бесплотным Небесным Силам, в среду — святым женам-мироносицам Марфе и Марии и в пятницу — Божьей Матери или Страстям Христовым. В часовне, сооруженной в конце сада, читался Псалтирь по покойникам. Часто ночами молилась там сама настоятельница. Внутренней жизнью сестер руководил замечательный священник и пастырь — духовник обители, протоирей Митрофан Серебрянский. Дважды в неделю он проводил беседы с сестрами. Кроме того, сестры могли ежедневно в определенные часы приходить за советом и наставлением к духовнику или к настоятельнице. Великая княгиня вместе с отцом Митрофаном учила сестер не только медицинским знаниям, но и духовному наставлению опустившихся, заблудших и отчаявшихся людей. Каждое воскресенье после вечерней службы в соборе Покрова Божьей Матери устраивались беседы для народа с общим пением молитв.
Богослужение в обители всегда было великолепным благодаря пастырским достоинствам духовников, приглашаемых настоятельницей. Сюда приходили для совершения богослужений и проповедования лучшие пастыри и проповедники не только Москвы, но и многих отдаленных уголков России. Как пчела собирает нектар со всех цветов, чтобы люди ощутили особый аромат духовности, так и настоятельница собирала лучших пастырей. Обитель, ее храмы и богослужение, вызывали восхищение современников. Этому способствовали не только храмы обители, но и прекрасный парк с оранжереями — в лучших традициях садового искусства XVIII–XIX веков. Это был единый ансамбль, соединявший гармонично внешнюю и внутреннюю красоту.
Великая княгиня совсем не имела высокого мнения о своих качествах… У нее никогда не было слов «не могу», и никогда ничего не было унылого в жизни Марфо-Мариинской обители. Все было там совершенно как внутри, так и снаружи. И кто бывал там, уносил прекрасное чувство».
В Марфо-Мариинской обители Великая княгиня вела жизнь подвижницы. Спала на деревянной кровати без матраца. Строго соблюдала посты, вкушая только растительную пищу. Утром вставала на молитву, после чего распределяла послушания сестрам, работала в клинике, принимала посетителей, разбирала прошения и письма.
Вечером, — обход больных, заканчивающийся за полночь. Ночью она молилась в молельне или в церкви, ее сон редко продолжался более трех часов. Когда больной метался и нуждался в помощи, она просиживала у его постели до рассвета. В больнице Елизавета Федоровна брала на себя самую ответственную работу: ассистировала при операциях, делала перевязки, находила слова утешения, стремилась облегчить страдания больных. Они говорили, что от Великой княгини исходила целебная сила, которая помогала им переносить боль и соглашаться на тяжелые операции.
В качестве главного средства от недугов настоятельница всегда предлагала исповедь и причастие. Она говорила: «Безнравственно утешать умирающих ложной надеждой на выздоровление, лучше помочь им по-христиански перейти в вечность».
Сестры обители проходили курс обучения медицинским знаниям. Главной их задачей было посещение больных, бедных, брошенных детей, оказание им медицинской, материальной и моральной помощи.
В больнице обители работали лучшие специалисты Москвы, все операции проводились бесплатно. Здесь исцелялись те, от кого отказывались врачи.
Исцеленные пациенты плакали, уходя из Марфо-Мариинской больницы, расставаясь с «Великой матушкой» как они называли настоятельницу. При обители работала воскресная школа для работниц фабрики. Любой желающий мог пользоваться фондами прекрасной библиотеки. Действовала бесплатная столовая для бедных.