Если у вас нет ни агара, ни желатина, ни крахмала — культивируйте на плотиках из фильтровальной бумаги. Когда мы проводили работы по селекции каллусов на среде с ПЭГ (очень сильный осмотик, имитирующий засуху в этих экспериментах), то столкнулись с проблемой — агар в присутствии высоких концентраций полиэтиленгликоля не застывал после автоклавирования. Выход был найден — на дно пробирок или баночек клали комочек ваты (рыхлый), сверху — вырезанный по диаметру сосуда кусочек фильтровальной бумаги, заливали жидкой питательной средой так, чтобы ее уровень не превышал 1 мм над поверхностью бумаги. Высота столбика среды в пробирке диаметром 2 см — примерно 1–1,5 см, в баночке из под детского питания — 0,5 см.
В качестве мерной посуды можно использовать то, что продается в хозяйственных магазинах для домовитых хозяек — мерные стаканы. Для более мелких доз — в аптеке вы найдете шприцы в ассортименте, которые прекрасно заменят вам мерные пробирки и пипетки. Ультрафиолетовые лампы сейчас можно купить в хозяйственном магазине. Там же вы найдете хлорный отбеливатель для стерилизации экспланта. Сухожаровой шкаф с успехом заменит обычная духовка газовой или электрической плиты.
Правила стерильной работы в лаборатории
Выращивание изолированных клеток, тканей, органов, растений-регенерантов, водных культур и грибов, используемых в биотехнологии, проводят в условиях полной асептики, т. е. стерильно. Особое внимание следует обратить на чистоту посуды, предназначенной для приготовления питательных сред и их компонентов; на подготовку объектов к пересадке, пассированию и культивированию. Только некоторые объекты (хлорелла, азолла) можно выращивать в нестерильных условиях.
Приемы и методы стерилизации
Стерилизация — полное уничтожение микроорганизмов и их покоящихся форм (например, спор). Существуют разные методы стерилизации: с помощью влажного пара, сухого пара, облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.
Обработка влажным паром производится в автоклавах. Вегетативные клетки бактерий и грибов гибнут через 5-10 минут уже при температуре около 60 °C; для гибели спор дрожжей и грибов требуется температура 120 °C в течение 15 минут. Продолжительность автоклавирования зависит от величины (теплоемкости) пробирок, колб и объема питательной среды в них. Иногда автоклавируют несколько раз — дробная стерилизация. Этот прием используют для стерилизации, как питательных сред, так и посуды.
Стерилизация посуды.
Большинство культур в лабораторных условиях выращивают в пробирках, колбах Эрленмейера различного объема и чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика[80]). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:
1. Посуду выдерживают в автоклаве под давлением в течение 20–40 минут при температуре 100–130 °C. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы — 20–40 минут, при 1 атм. — 15 минут.
2. При сухом способе стерилизации чашки Петри, колбы, стаканы, завернутые в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140 °C в течение 2 часов, при температуре 180 °C — 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.
Стерилизация инструментов.
Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т. д.) стерилизуют в сушильном шкафу способом № 2. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают.
Стерилизация материалов.
Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25–30 мин.
Стерилизация питательных сред.
80
Это пришло от химиков. На практике лучше всего мыть с применением пищевой соды. Следовые количества детергентов отмыть очень сложно, и как результат они влияют отрицательно на рост клеток. Хромпик же вещь вообще очень агрессивная, мыть им посуду следует только после пятидесятилетнего использования. Это мнение редакции, но проверено на опыте.