Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов добавляют различные факторы роста, например, аминокислоты, пуриновые основания и их производные, РНК и продукты её гидролиза. В качестве источника углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы Mg, Mn, Zn, Fe, Си и др. металлов. Механизм действия большинства из них неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Са повышают устойчивость а-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты.
Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием компьютера. Последний, естественно, предпочтительнее. По характеру культивирования все технологические процессы производства ферментных препаратов делятся на две большие группы: глубинный и поверхностный методы.
Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов
В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.
При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.
1. Приготовление питательных сред зависит от состава компонентов. Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До — потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после — так как несет клетки продуцента.
2. Получение засевного материала. Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий — молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3–4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается толь ко вегетативно, он резко возрастает (до 5-20 %). Если же происходит обильное спороношение — сокращается до 1 %.
3. Производственное культивирование. Биосинтез ферментов в глубинной культуре протекает в течение 2–4 суток при непрерывной подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22–32 °C. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в ЭВМ, которая определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.
4. Выделение. В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15 % ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы.
5. Получение товарной формы.
Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов
При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды[62]. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.