Приведем пример. На рис. 4.9 верхняя молекула имеет атом кислорода, связанный с атомом водорода в положении 3' (атомы углерода в кольце нумеруются цифрами 1', 2 ', 3', 4 ' и 5'), тогда как у атома водорода в положении 4' атом кислорода отсутствует (отсюда приставка дезокси-). У нижней молекулы атом водорода отсутствует на позициях 3' и 4', поэтому ее название начинается с приставки дидезокси-. Из-за такой разницы в строении, когда при сборке молекулы ДНК в нее встраивается дидезоксидное основание, она уже не связывается с другим нуклеотидным основанием (в позиции 5'), и цепь ДНК обрывается в этом месте.
Рис. 4.9. Дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) и дидезокситимидинтрифосфат (ддТТФ)
То же происходит с другими основаниями ДНК (аденином, гуанином и цитозином). В итоге можно получать ДНК различной длины (на изображениях молекул пустые углы на кольцах соответствуют атомам углерода).
Сенгеровский метод обрыва цепи дидезоксидными основаниями для секвенирования ДНК начинается с того, что посредством рестрикционных ферментов расщепляют подвергаемую секвенированию ДНК на меньшие участки, а ДНК нагревают до полного разделения обеих ее нитей. Затем к этим однонитевым участкам ДНК добавляют трифосфаты с дидезоксидным основанием, после чего вводится белковый фермент ДНК полимераза, который приступает к сборке копий исходной ДНК. Из-за дидезоксидных оснований собранные молекулы представляют собой не копии исходной ДНК, а смесь из полученных прежде участков ДНК. Предварительно дидезоксидные основания помечаются (маркируются) либо радиоактивным изотопом фосфора, либо чувствительным к ультрафиолетовому свету красителем, так что конец каждой оборванной цепи становится видимым.
Затем эту смесь цепей ДНК помещают в лунки пластины геля и дают электрическое напряжение. Более короткие участки испытывают меньшее сопротивление среды (обычно желе из водоросли агароза, схожее с желатином «Джелло»[9] вещество, с той лишь разницей, что молекулы там образуют дополнительные связи, делая гель прочным) и поэтому движутся быстрее. Часто в качестве образца в одну из лунок помещают цепи известной длины. После достижения наиболее короткими цепями края пластины геля напряжение снимают. По радиоактивным или флуоресцентным маркерам определяют нуклеотидное основание в конце каждой молекулярной цепи. Поскольку электрофорез распределяет молекулы в соответствии с возрастанием длины цепи, при просмотре виден порядок расположения парных оснований нуклеотидов в исходной ДНК.
Данный метод широко применялся до середины 1980-х годов, и работа над диссертацией у многих аспирантов заканчивались участием в многолетнем проекте по секвенированию определенной части ДНК одного из модельных организмов. Приходилось брать пробы у организма, очищать, смешивать с химическими реактивами, выращивать, помещать в гель и проводить исследование, после чего собирать и толковать данные. Работа была тяжелой и продвигалась медленно. Обычно в ходе написания диссертации удавалось выстроить участок в 40 тыс. парных оснований ДНК.
Секвенирование генома человека
Озвучивая мнения многих влиятельных биологов, в номере Science за 7 марта 1986 года Ренато Дульбекко, глава Института биологических исследований им. Солка[10], призвал к претворению в жизнь грандиозной программы по расшифровке генома человека. Он доказывал, что столь огромные усилия необходимы для понимания роли генов в развитии рака. Некоторые биологи, вроде Уолтера Гилберта (известного гипотезой РНК-мира), с радостью восприняли это предложение. Гилберт сказал: «Полный геном человека — Грааль генетики человека» (подробнее об этом сравнении далее).
Другие выразили озабоченность, что подобный гигантский проект исказит биологию до неузнаваемости. Расшифровка 3 млрд. пар азотистых оснований с помощью имеющихся на тот час средств потребует 15-летней непрерывной работы 10 тыс. аспирантов и обойдется примерно в 3 млрд. долларов. При таких затратах человеческих и денежных ресурсов ничего не останется на все остальные биологические проекты.
Луч надежды блеснул с появлением автоматизированных устройств секвенирования. Центр исследования человеческого генома [ныне Национальный институт генома человека], подразделение [сети институтов, объединенных общим названием] Национального института здоровья (НИЗ), официально приступил к работе в октябре 1990 года под руководством Джеймса Уотсона — да, самого Джеймса Уотсона. Данный проект задумывался как международный: большинство работ поручалось различным государственным лабораториям и университетам в США, и около трети приходилось на долю Великобритании, Франции, Германии и Японии.
9
«Джелло» (Jell-O) — полуфабрикаты желе и муссов, выпускаемые в порошке крупнейшим в США производителем пищевых продуктов Kraft Foods Inc., дочерней компанией Philip Morris Cos.
10
В 1963 году основал в пригороде Сан-Диего (штат Калифорния) Институт биологических исследований, названный его именем.