11 (22) октября 1715 года, незадолго до рождения царевича Петра, царь написал Алексею так называемый «тестамент» (завещание, напутствие), в котором указал сыну на его «непотребности» к управлению государственными делами: незаинтересованность в воинском деле, телесная слабость, лень, упрямство. В заключение Петр I подчеркнул цель своего напутствия:
«… все я с горестию размышляя и видя, что ничем тебя клонить не могу к добру, за благо изобрел сей последний тестамент, тебе написать и еще мало пождать, аще нелицемерно обратишся. Ежели же ни, то известен будь, что я весма тебя наследства лишу, яко уд гангренный, и не мни себе, что один ты у меня сын, и что я сие только в устрастку пишу, воистинно (богу изволшу) исполню, ибо я за мое отечество и люди живота своего не жалел и не жалею, то како могу тебя непотребнаго пожалеть, лучше будь чужой добрый, неже свой непотребной.»
Алексей испросил позволения уйти в монастырь. Отец в свою очередь дал наследнику полгода срока, чтобы тот подумал и сообщил о своем окончательном выборе. Вскоре после этого разговора, в начале 1716 года, Петр I отправился в почти двухлетнюю поездку по Западной Европе.
Конфликт с отцом тяготил и пугал царевича. Воспользовавшись отъездом царя, Алексей под предлогом поездки к отцу в Копенгаген покинул страну и отправился в Вену к свояку — императору Священной Римской империи Карлу VI. Узнав о бегстве сына, Петр I отдал приказ найти и вернуть его. Царевич был обнаружен сначала в замке в Тироле, а после того, как спешно покинул Тироль и снова скрылся — в неаполитанском замке.
Получив приказ возвратить царевича в Россию, в Неаполь отправились опытные послы П.А Толстой и А. И. Румянцев. С ними же Петр I отправил царевичу грозное письмо со следующими словами:
«Буде же побоишся меня, то я тебя обнадеживаю и обещаюсь Богом и судом его, что никакого наказания тебе не будет, но лутчую любовь покажу тебе, ежели воли моей послушаеш и возвратишся. Буде же сего не учиниш, то яко отец данною мне от Бога властию проклинаю тебя вечно, а яко Государь твой, за изменника объявлю и не оставлю всех способов тебе яко изменнику и ругателю отцову учинить, в чем Бог мне поможет в моей истине.»
Царевич получил это письмо из рук Толстого и Румянцева, но оно не смогло побудить Алексея вернуться: опека императора Карла VI позволяла ему противостоять воле отца. Лишь дипломатические уловки Толстого и Румянцева помогли расшатать уверенность царевича в надежности укрытия. В частности, Толстой прибег к помощи местного чиновника, который якобы по секрету рассказал Алексею о планах выдать его в Россию и о том, что решение это было якобы принято на самом высоком уровне — лично императором. Сопровождавшая Алексея в побеге бывшая крепостная Ефросинья Федорова, поддавшись на уговоры послов, тоже стала склонять царевича вернуться в родные края. Алексей успел отправить шведскому королю Карлу XII послание с просьбой приютить его, но, так и не дождавшись ответа, после долгих колебаний дал согласие на возвращение в Россию.
3 (14) февраля 1718 года, практически сразу по прибытии в Москву, царевич встретился с отцом. Петр I поставил Алексея перед фактом — царевич лишался наследства и права на престол. Новым наследником назначался младший сын императора, двухлетний Петр. От Алексея требовали подписать отречение от прав на престолонаследование, присягнуть на верность новому наследнику и полностью отказаться от попыток взойти на престол после смерти батюшки. Алексей письменно дал «клятвенное обещание» «воле родительской во всем повиноваться и того наследства никогда ни в какое время не искать и не желать и не принимать ни под каким предлогом». В этом же документе царевич признал брата своего Петра истинным наследником престола и скрепил это целованием креста в Успенском соборе Кремля.
В тот же день в присутствии духовных и светских иерархов манифест о лишении царевича прав на российский престол и его «клятвенное обещание» были публично зачитаны. Такая открытость церемонии должна была зафиксировать факт добровольного отказа царевича Алексея от прав на престол и подтвердить правомерность назначения царевича Петра новым наследником престола. Однако этим дело не закончилось. Царя интересовали противники его царствования, надеявшиеся на царевича и способствовавшие его бегству за рубеж. Начались допросы и розыск советчиков Алексея.