Такое поведение породило разлад между императором и его сыновьями. Заметнее всего это проявилось в отношениях с наследником престола, Александром: не будучи изначально доверительными, на фоне упомянутых событий они окончательно пересекли грань подозрительности. Возникла угроза лишения Александра прав на престол. И без того напряженную атмосферу в высших кругах подогревали слухи о предстоящем рождении двух незаконных детей императора. Рожденные вне брака, прав наследования они не имели, но страх перед возможной передачей престола кому-либо из них по воле императора висел в воздухе. Подобная перспектива не устраивала в первую очередь членов императорской семьи, а также тех из окружения императора, кто связывал свое будущее с правлением старшего сына Павла I. Многие считали либерального, внушаемого и самолюбивого Александра более удобным правителем по сравнению с непредсказуемым и жестким Павлом.
К концу 1800 года внешняя политика Российского государства кардинальным образом изменилась. Первоначально по восшествии на престол Павел I на европейской арене продолжал политику своей матери и курс на продолжение борьбы с революционной Францией. Однако военные неудачи и непоследовательные действия бывших союзников заставили изменить планы. В сентябре 1799 года в Швейцарии, во второй битве при Цюрихе, французскими войсками был разгромлен 27-тысячный русский корпус под командованием А. М. Римского-Корсакова. Это стало крупнейшим поражением русских войск за весь XVIII век. Проигрышную кампанию не спасли даже великолепные действия Суворова в северной Италии и знаменитый переход через Альпы. Неудачу потерпела и совместная русско-английская экспедиция в Голландию в августе — ноябре 1799 года.
Последней каплей стал захват английским флотом острова Мальта в сентябре 1800 года. Будучи великим магистром Мальтийского ордена и рассчитывая устроить здесь базу для русского военного флота, Павел I воспринял захват острова как личное оскорбление. Союз с Австрией и Англией был разорван. В декабре 1800 года Россия, Пруссия, Швеция и Дания сформировали новую коалицию и заключили союзный договор, целью которого была борьба с влиянием Англии. Кроме того, Павел I предпринял попытки сближения с наполеоновской Францией. В частности, он потребовал от французского короля в изгнании Людовика XVIII, прежде нашедшего убежище в России, покинуть страну и лишил его денежного содержания. А накануне 1801 года Павел I отправил корпус донских казаков на завоевание английских владений в Индии. Такой поворот не устраивал Англию: следовало вернуть Россию в сферу ее контроля.
Так наметился круг лиц, заинтересованных в полном, следовательно — физическом устранении действующего императора. Заговор возглавили Петр Пален и Никита Панин. Первый ко времени цареубийства состоял военным губернатором столицы и слыл близким сподвижником Павла I. Тем не менее, чувствуя шаткость своей позиции, он все же решился на убийство императора. Второй был дипломатом, противником сближения с Францией, активно готовил цесаревича Александра к принятию власти, но на момент покушения был отстранен от всех дел, и его старания были реализованы другими заговорщиками. В литературе отмечается, что готовящийся заговор, вероятно, отчасти финансировало английское правительство.
До Павла I о заговоре доходили туманные донесения. По некоторым сведениям, за несколько дней до убийства он спросил Палена: «Говорят, что против меня имеется заговор и ты один из заговорщиков?» Пален, впрочем, нашелся, что ответить, и император на время успокоился. В эти дни Павел I вел себя очень мнительно: повелел заколотить дверь в покои императрицы, поскольку ждал опасности с ее стороны; заставил всех членов императорской семьи присягнуть себе на верность; по словам Палена, предоставил ему письменное повеление арестовать императрицу и наследника в случае такой необходимости. Ставшее легендой воспоминание об отражении императора в кривом зеркале то ли со свернутой шеей, то ли с искривленным ртом также добавляет красок в описание испуганного и безысходного состояния Павла I накануне трагедии.
Вечером 11 (23) марта 1801 года заговорщики по пригласительным билетам собрались у Палена на ужин. Было их человек 40–60, в основном офицеры, пили много шампанского. Платон Зубов, бывший фаворит Екатерины II и активный участник заговора, сообщил о причинах собрания: добиться ареста императора и отречения его от престола. После ужина офицеры разделились на две группы во главе с Паленом и Зубовым и отправились в императорскую резиденцию — Михайловский замок. Группа Палена вошла во дворец через главный южный вход, группа Зубова — через западный. К полуночи заговорщики достигли императорских комнат, устранили часового и комнатную прислугу и проникли в спальные покои. На первый взгляд там не было никого; и все же после тщательного обыска из угла в спальне извлекли перепуганного Павла.