После смерти Фердинанда возник вопрос о том, кому принадлежит право назначения великого инквизитора. Папа Адриан VI утверждал, что предоставленная Фердинанду привилегия в этом деле носила индивидуальный характер и не должна переходить на следующего испанского монарха. Карл V не уступал и настаивал на своем праве назначать великого инквизитора, пусть и с согласия папы. В конце концов ему удалось добиться своего: после долгих переговоров 10 сентября 1523 года великим инквизитором стал его кандидат Алонсо Манрике, епископ Кордовы. Император торжествовал, но победа эта не носила принципиального характера, так как Адриан не только не связал себя на будущее никакими обещаниями, но и ясно дал понять, что соглашается лишь постольку, поскольку находит Алонсо Манрике наиболее подходящим кандидатом на пост великого инквизитора. По-видимому, император с этим согласился; во всяком случае, право папы в вопросе назначения великого инквизитора никем из испанских королей вплоть до Карла III не оспаривалось.
В 1774 году сложил с себя полномочия великий инквизитор Мануэл Кинтано Бонифас. Король отправил папе просьбу о назначении на его место саламанкского епископа Фелипе Бертрана, но ухитрился написать письмо так, что в нем собственно говорилось не о согласии папы предоставить Бертрану генеральное инквизиторство, а о необходимости освободить его от епископского места в Саламанке ввиду назначения великим инквизитором. Письмо Карла в курии получили в тяжелую минуту, когда после смерти 22 сентября 1774 года Климента XIV папский престол был свободен. Избранному 15 февраля 1775 года новым папой Пию VI было не до борьбы с Карлом, и 27 февраля он исполнил желание испанского короля. Правда, послание Пия мало чем отличалось от послания в 1755 году папы Бенедикта XIV при назначении великим инквизитором Бонифаса — в нем, как и прежде, говорилось о motu proprio папы. Та же формула была использована и при назначении Пием VI в 1784 году великим инквизитором Рубина де Севальоса.
Вопрос о том, может ли король сместить великого инквизитора, юридически не был оформлен, но столкновение светской власти с Манрике ясно показывает, что фактически король мог поставить великого инквизитора в положение, мало чем отличающееся от вынужденной отставки. Алонсо Манрике считался фаворитом императорской четы. В 1529 году Карл V, отправляясь в Италию, назначил императрицу опекуншей над юной графиней Луизой де Акунья, руки которой добивались самые аристократические женихи и среди них племянник великого инквизитора граф Тревиньо. Императрица поселила опекаемую невесту в самое безопасное, как ей казалось, место — в монастырь, но Манрике именно этим и воспользовался — пользуясь своей громадной властью, он устроил там свадьбу Луизы с графом Тревиньо. Императрица в ярости удалила Манрике из королевского дворца и приказала ему жить в его севильской епархии до тех пор, пока Карл вернется из Италии. Увещевания инквизиции не смогли изменить решения императрицы, и лишь в 1533 году, когда Карл возвратился в Испанию, Манрике смог снова свободно исполнять обязанности великого инквизитора. Правда, продолжалось это недолго: через год между ним и Карлом произошел новый конфликт, и Манрике опять был отправлен в Севилью, хотя номинально оставался великим инквизитором.
Другой случай столкновения между королевской властью и великим инквизитором произошел в 1598 году, когда Филипп III, под влиянием герцога Лермы невзлюбив великого инквизитора Портокарреро, обратился к папе Клименту VIII с просьбой издать буллу, принуждающую епископов жить в своих епархиях. Как епископ Куэнки Портокарреро вынужден был подать в отставку, покинуть Мадрид и переехать в Куэнку. Из-за этой же буллы покинул свой пост и следующий за Портокарреро великий инквизитор — кардинал Ниньо де Гевара. Его преемник Хуан де Суньига, епископ Картахены, обошел буллу Климента VIII, предоставив папе управление своей епископией на время своего генерального инквизиторства; но вместе с тридцатитысячным доходом от своей епархии Суньига потерял и здоровье. Мадридский климат оказался ему вреден, и он умер в том же 1602 году, когда и был назначен.
Когда Филипп IV вступил в 1621 году на престол и подпал под влияние Оливареса, между последним и великим инквизитором Луисом де Алиагой, обладавшим сначала вместе с герцогом Лермой, а затем с герцогом Уседой наибольшим могуществом при дворе Филиппа III, неизбежно должен был произойти конфликт. Перемена на троне в глазах Оливареса означала прежде всего разрыв с политикой предыдущего короля Филиппа III, которую олицетворяли великий инквизитор Алиага и всесильный Уседа. Но воспользоваться против Алиаги буллой 1598 года было невозможно, так как доминиканец Алиага не был епископом и, следовательно, не имел своей епархии. Светская власть оказалась в большом затруднении, столкнувшись лицом к лицу с независимым положением великого инквизитора. Наконец, не найдя лучшего способа избавиться от Алиаги, Филипп IV приказал ему покинуть королевскую резиденцию и отправиться в доминиканский монастырь в Уэте. Хотя великий инквизитор исполнил приказание короля, вопрос о нем не мог считаться решенным, и потребовалось вмешательство папы Григория XV, чтобы вынудить его подать в отставку. Вскоре мадридский трибунал обвинил Алиагу в лютеранстве и материализме, но до суда дело не дошло, так как отставной великий инквизитор умер в 1626 году, до окончания следствия, которое в связи с этим решили не продолжать.