Первым серьезным ударом, имевшим колоссальные последствия, была преждевременная смерть Сергея Королёва в январе 1966 года. Все еще анонимный Генеральный конструктор был мощной центральной фигурой, который без устали трудился над тем, чтобы удерживать Советский Союз на передних рубежах новой космической эры. Он возвышался над своими современниками как волевой и прогрессивный лидер. Вместе с Вернером фон Брауном Королёв всегда предвидел, что человек будет исследовать космос, успешно разрабатывая военные ракетные программы, которые также служили достижению его цели. Однако к концу 1965 года бремя, лежащее на Королёве, значительно увеличилось. В условиях, когда в высшей степени конкурентоспособная американская программа «Аполлон» набирала силу, Королёв оказался в тяжелом положении, пытаясь сохранять советскую космическую программу жизнеспособной. Но даже для требовательного Королёва темп был слишком высок.
Его контроль над событиями в Советском Союзе был осложнен, если не окончательно разрушен, с приходом новых соперников — Владимира Челомея и Валентина Глушко, которые были полны решимости оставить свой след в советской космической программе. Челомей был талантливым конструктором ракет и возглавлял конструкторское бюро ОКБ-52. Главной сферой его деятельности были крылатые и баллистические ракеты, которые в то время являлись жизненно важным приоритетом для Советского Союза. Челомей добился покровительства Хрущева, что делало его влиятельной фигурой в обстановке соперничества, в которой осуществлялась советская космическая программа. Глушко был одно время помощником Королёва и известным специалистом в области реактивных двигателей. Всегда на заднем плане находилось советское военное ведомство, которое время от времени оказывало сильное сопротивление космической программе, считая, что она поглощает все ресурсы, которые могли бы более разумно выделяться на исследование и разработку ракет.
Частично из-за обостренных внутренних бюрократических распрей здоровье Королёва стало стремительно ухудшаться. Первые признаки надвигающегося кризиса появились в декабре 1965 года, когда он с трудом вырвал время из своего рабочего графика, чтобы пройти медицинское обследование кишечника, в котором обнаружился кровоточащий полип. Сначала и Королёв и врачи сочли, что полипы доброкачественного происхождения, от которых можно было избавиться путем несложной хирургической операции. Королёв поступил в московский госпиталь для хирургического вмешательства 14 января 1966 года, через два дня после своего 59-го дня рождения. Борис Петровский, выдающийся московский врач и чиновник, занимавший высокий правительственный пост, лично отвечал за операцию, выражая уверенность, что полипы можно без труда удалить, даже заверяя своего пациента, что он сможет продолжать свою работу еще 20 лет. В тот роковой день Петровский был спокоен и благодушен и даже назначил еще одну операцию на тот же день.
Дочь Королёва, Наташа Королёва, оставила краткий, но емкий отчет о том, что произошло: «Хирург… начал операцию в 8 часов утра, применив ректоскоп для удаления полипов эндоскопическим способом. На операционном столе у моего отца началось сильное кровотечение, которое не могли остановить. Петровский вскрыл брюшную полость, чтобы прекратить кровотечение, и обнаружил злокачественную опухоль, которая была не выявлена до этого». В тот момент Петровский оказался в сложнейшей ситуации и яростно пытался спасти жизнь своего пациента. Дочь Королёва описала последние минуты своего отца: «Петровский начал удалять часть прямой кишки, чтобы извлечь опухоль. На это ушло много времени. Отец пролежал под маской с анестезией восемь часов. Следовало бы ввести в его легкие трубку, но его челюсти были сломаны в тюрьме, поэтому этого нельзя было сделать. Его сердце было в плохом состоянии, и Петровский это знал. Он закончил операцию, но отец так и не пришел в сознание».
Смерть Королёва, такая неожиданная и катастрофическая, привела отряд советских космонавтов в отчаяние. Гроб с его телом был выставлен в Колонном зале Дома Союзов, вблизи Кремля, что явилось запоздалым признанием долгому служению Королёва Советской стране. Открытый гроб стоял на высоком пьедестале в богато украшенном зале, в окружении белых колонн, увитых красными и черными лентами, и был усыпан цветами. Во время церемонии прощания, когда мимо гроба шел бесконечный поток людей, в зале звучала музыка Чайковского и Бетховена. Впервые Сергею Петровичу Королёву была публично выражена признательность в некрологе, напечатанном в газете «Правда» вместе с его фотографией. Ему были отданы и другие почести Советского Союза, включая специальный парад на Красной площади. Тело Королёва было затем кремировано и его прах помещен в Кремлевскую стену — честь, которой его удостоили главные руководители Советского Союза — Брежнев и Косыгин. Даже в New York Times 16 января 1966 года появилось сообщение о смерти Королёва, напечатан некролог, и читатели газеты узнали, что он был конструктором советских искусственных спутников и пилотируемых космических кораблей.