Така відверто пропольська політика зумовила швидку появу литовсько-руської опозиції, яку очолив князь Вітовт (1392–1430). Підтриманий зброєю литовських феодалів та руських удільних князів, він 1392 р. був визнаний довічним правителем Литовського князівства. Намагаючись зміцнити внутрішню політичну єдність власної держави, максимально централізувати управління, Вітовт незабаром переходить до ліквідації південно-західних руських удільних князівств — Волинського, Новгород-Сіверського, Київського, Подільського. У цих землях починають управляти великокнязівські намісники. Внаслідок цього посилюється соціальний гніт і зводиться нанівець колишня автономія українських земель. Виношуючи плани «великого княжіння на всій Руській землі», Вітовт постійно розбудовував систему опорних укріплень у Барі, Брацлаві, Звенигороді, Жванці, Черкасах та інших містах. Проте ці плани так і не вдалося реалізувати. Поступальний рух на схід було припинено, в 1399 р. у битві з татарами на Ворсклі загинули найкращі військові формування Литви та Русі. Водночас воєнний потенціал князівства був ще значним, про що свідчить перемога об'єднаних сил слов'ян і литовців над Тевтонським орденом 1410 р. під Грюнвальдом.
Нова польсько-литовська унія 1413 р. у Городлі стала свідченням зростаючої дискримінації православного населення. Відповідно до цього документа католики могли брати участь у великокняжій раді, участь православних у державному управлінні обмежувалася. Розширенню сфери впливу католицизму сприяли роздача католицькій церкві українських земель, заснування католицьких єпископських кафедр у Кам'янці-Подільському та Луцьку. Подальше зближення та блокування польської та литовської шляхти поступово зміщувало акценти визвольної боротьби в українських землях: поряд з антипольським наростає антилитовський рух, що вилився в народні виступи 1440 р. на Волині та Київщині. Намагаючись проводити гнучку внутрішню політику, литовська верхівка спершу іде на відновлення Київського та Волинського удільних князівств, але протягом короткого часу (1452–1471) навіть ці залишки автономії українських земель були остаточно ліквідовані, а землі стали звичайними провінціями Литви.
IV етап (1480–1569) — посилення литовсько-російської боротьби за право бути центром «збирання земель Русі». Остаточна втрата українськими землями у складі Литви автономних прав у часі збіглася з піднесенням Московського князівства. Консолідуючи навколо себе навколишні землі, воно трансформувалося в єдину централізовану Російську державу. З поваленням 1480 р. ординського іга Москва дедалі гучніше та активніше заявляє про себе як про центр «збирання земель Русі». Вже 1489р. Іван III вперше зауважує великому князю литовському та королю польському Казимиру: «Наши города, и волости, и земли, и воды король за собою держит».
Початок XVI ст. характеризується загостренням московсько-литовського протистояння. Війни та збройні сутички тривали майже безперервно — 1500–1503, 1507–1508, 1512–1522 pp. Під час невщухаючої боротьби російська сторона неухильно намагалася довести, що саме цар і є справжнім «государем усієї Русі». За цих обставин під впливом зростаючого соціального гніту, релігійної дискримінації, загрози ополячення та окатоличення н умовах ліквідації залишків автономії в українських землях помітно поширюються проросійські настрої. Це виявляється в добровільному переході під владу Москви деяких князів зі своїми володіннями (Чернігово-Сіверські князі, Бєлєвські, Воротинські, Новосильські, Одосвські, Шемячич); в організації змов і повстань (1481 р. невдала змова Олельковича, Бєльського та Гольшанського з метою вбивства короля Казимира, 1507 р. анти-литовське повстання князя М. Глинського на Київщині та Поліссі); втечах та переселенні селян до Російської держави та ін.
Намагаючись максимально сконцентрувати сили проти своїх зовнішніх ворогів, Польща і Литва 1569 р. укладають Люблінську унію. Утворюється нова держава — Річ Посполита. З цього моменту українські землі опиняються у складі Польщі. Починається якісно новий етап їхнього розвитку.
Отже, перебування українських земель у складі Великого князівства Литовського тривало декілька віків. У середині XIV ст. розпочалося м'яке, «оксамитове», але досить активне литовське проникнення у землі колишньої Київської Русі. У цей час Литва намагалася толерантно ставитись до місцевого населення, органічно сприймати його традиції та досвід. Після укладення Кревської унії (1385) українські землі остаточно втрачають залишки автономії, а з 1480 р. потрапляють в епіцентр московсько-литовського протистояння. Після утворення Речі Посполитої (1569) вони стають частиною Польщі, що призводить до ополячення та окатоличення українського люду.