Значні якісні зміни відбулися в духовній культурі. Протягом XIV–XV ст. на ґрунті давньоруської мови під впливом народного мовлення сформувалася «руська мова», що стала офіційною державною мовою в Литовській державі. «Руська мова» — це певна спільна основа, сходинка в становленні української та білоруської національних мов. На зламі XV–XVI ст. сформувалися дві окремі літературні мови — староукраїнська та старобілоруська. Якщо до утворення Речі Посполитої (1569) функціонування руської мови було досить вільним, то після переходу Волині, Брацлавщини, Київщини до складу Польської держави вона зазнає дискримінації. Та все ж, незважаючи на утиски, українська мова не тільки не здає позиції, а розширює сфери вжитку, збагачує свою стилістику. Поряд з вже традиційними юридично-діловим і літописним стилями, перекладною літературою, ораторсько-проповідницькою прозою бурхливо розвивається полемічний стиль (Г. Смотрицький, І. Вишенський, С. Зизаній), зароджується науковий (у лікарських посібниках, граматиках, словниках), виникає українське віршування (Г. Смотрицький, Д. Наливайко та ін.).
Глибоко позначилася на духовній культурі специфічна ситуація в релігійній сфері, що склалася в українських землях XV–XVI ст. Безперервне протистояння католицтва і православ'я зумовило укладення Берестейської унії (1596) та утворення уніатської церкви, що посилило гостроту релігійних та національних конфліктів. Релігійне Протистояння мало не тільки негативні наслідки. Намагаючись укріпити власні позиції, протидіючі сторони мусили дбати про розвиток освіти, поширення свого впливу через розбудову шкіл. Релігійна полеміка збуджувала думку, сприяла розвиткові культури дискусії, формуванню полемічного стилю.
Реальні потреби господарського та культурного життів, поширення ідей гуманізму, намагання представників ріпних релігійних конфесій розширити свою соціальну пішу зумовили якісні зміни у сфері освіти. У XV–XVI ст. поряд з традиційними школами при церквах та монастирях виникають протестантські та католицькі школи, що давали вищий рівень знань. Намагаючись протидіяти поширенню чужих впливів, православні засновують свої освітні заклади. Так, у сфері освіти з'являється новий тип школи — греко-слов'яно-латинська, у навчальному процесі якої органічно поєднувалися давньоруська традиція й новітні надбання західноєвропейської думки. Першим освітнім закладом цього типу в українських землях стала Острозька академія (1576), заснована князем К. Острозьким. У своїх стінах вона зібрала квіт тогочасної української та зарубіжної інтелектуальної еліти, її викладачами були Г. Смотрицький, В. Суразький, Д. Наливайко, чужоземці — відомі вчені К. Казимирський. Я. Лятош, К. Лукаріс, який незабаром став патріархом константинопольським. Своєрідну естафету Острозька академія передала братським школам, перша з яких виникла 1586 р. у Львові. Наприкінці XVI — на початку XVII ст. школи цього типу діяли в Перемишлі, Кам'янці-Подільському, Галичі, Холмі та інших містах.
Падіння в середині XV ст. Візантійської імперії зумовило докорінний переворот у духовному житті українського суспільства. Після певної паузи в поступальному розвитку культури, своєрідного інтелектуального та культурного застою, розпочинається переорієнтація на західну цивілізацію, активне засвоєння на ґрунті києво-руської духовності надбань західноєвропейської культури. Виявами цих якісних змін у духовній сфері України стали: 1) відхід від візантійських зразків та канонів (у XV–XVI ст. в іконописі постаті святих виходять за межі візантійських умовностей, набувають рис індивідуальності, передається динаміка руху); 2) поширення ідей гуманізму та реформації; 3) поява нових форм самовираження і мистецьких стилів (у літературі набуває поширення полемічний стиль, виникає українське віршування; у живописі наприкінці XVI ст. з'являються нові жанри — портрет, історичний живопис, зростає інтерес до пейзажу; виникають такі жанри світської музики, як побутова пісня для триголосого ансамблю або хору (кант), сольна пісня із супроводом; у 1573 р. створюється вітчизняний ляльковий театр, що надалі переростає в традицію українського вертепу; зароджується стиль бароко; 4) посилення світського елементу в культурі, зростання уваги до людини та її духовного світу; 5) індивідуалізація творчості.