Окончательно же отказаться от активной политики на западном направлении Василия III вынудило осложнение отношений с крымским ханом, вызванное соперничеством за влияние на Казанское и Астраханское ханства. В сентябре 1522 г. между Вильно и Москвой было подписано перемирие.
Отошедшие от Вильно к Москве удельные княжества некоторое время сохраняли свою автономию. Однако четко обозначившаяся тенденция к централизации Московского государства шансов на длительную консервацию такого состояния не оставляла. После смерти князя Василия Семеновича в 1518 г. непосредственно в состав Великого княжества Московского было включено Стародубское княжество. В 1523 г. подобная же участь ожидала и Новгород-Северское княжество, отобранное у Василия Щемячича. Еще в 1514 г. по обвинению в измене был арестован и брошен в тюрьму Михаил Глинский.
Из-за спора о территориальной принадлежности Смоленска и Чернигово-Северщины «вечный мир» между Москвой и Вильно заключить так и не удалось. Во время очередной вспышки конфликта литовскому войску в августе 1535 г. удалось овладеть Стародубом, и в подписанном двумя годами позже перемирии московское руководство вынуждено было уступить Любеч и Гомель.
Вхождение украинских земель в состав Речи Посполитой
Новый мощный импульс к эскалации конфликта между Москвой и Вильно ситуация получает с момента реанимации в конце 50-х гг. Иваном IV Васильевичем (Грозным) курса своего деда Ивана III на обеспечение государству выхода к Балтийскому морю. В контексте решения этой задачи в начале 1558 г. первый российский царь начинает войну со своим бывшим союзником Ливонским орденом.
Уже к середине года царские войска стояли на берегу Балтики, а орден разваливался на отдельные образования. Впрочем, великий магистр Ордена, добровольно уступив значительные территории соседям, а также признав себя вассалом польского короля и великого князя литовского Сигизмунда, втянул в войну с Москвой Польшу, Литву, Швецию и Данию.
Для Вильно начальный период Ливонской войны складывался неудачно: 15 февраля 1563 г. 60-тысячной российской армии удалось овладеть хорошо укрепленным Полоцком, после чего оккупировать белорусские земли в районе Двины. Над княжеством нависла угроза значительных территориальных потерь, и в этих условиях актуальным становится вопрос о военной помощи Польши. Таким образом, давно популярная в среде рыцарства идея объединения с Короной и вследствие этого демократизации государственного устройства Великого княжества по польским образцам получает мощный внешнеполитический импульс.
Реагируя на требования шляхты о превращении личной унии с Короной Польской в унию реальную, Сигизмунд II Август в 1563–1568 гг. созвал шесть сеймов, на которых дебатировались различные аспекты предстоящего объединения государств.
Борьба за расширение политических прав рыцарства Великого княжества находит свое воплощение в серии проведенных в течение 1564–1565 гг. земских реформ. Начало реформам было положено привилеем великого князя Сигизмунда I Старого 1563 г., провозгласившим ликвидацию ограничений прав православных по сравнению с католиками, введенных Городельским актом 1413 г. (на практике это ограничение не действовало, ярчайшим подтверждением чему служит длинный реестр государственных и военных должностей православного магната К. Острожского — великого гетмана литовского, трокайского воеводы, виленского каштеляна, луцкого старосты, наместника винницкого и брацлавского и т. п.). В следующем году под давлением шляхты магнаты отреклись от своего особенного статуса в процессе судопроизводства и формально были уравнены в правах с остальным шляхетским сообществом. В княжестве внедрялись общие выборные шляхетские суды. Согласно Виленскому привилею 1565 г., вся территория княжества была разделена на 30 поветов, в которых организовывались земские и гродские суды. Шляхта того или иного повета была подсудна лишь выборному земскому суду, полностью независимому от великокняжеской власти. В компетенцию гродского (или замкового) суда, во главе которого стояли представители великокняжеской власти — воевода и староста, входили дела, связанные с разбоем, грабежами, поджогами.