Интерьер собора предстает сейчас также в сильно измененном виде. Первоначально его пространство обладало большой цельностью, а центричность архитектурной композиции была отчетливо выражена. Довольно узкие столбы прямоугольного сечения не загромождали, как сейчас, внутренность храма. Опирающиеся на них подпружные арки, поднятые над прилегающими сводами, создавали ступенчатый переход к необычно широкому барабану, увенчанному могучим куполом. Единство пространства было нарушено при ремонте в 1770-х годах, вызванном появившимися в стенах и сводах большими трещинами. Между столбами и стенами тогда выложили стенки, прорезанные арочными проемами. Еще позднее, при возведении западной пристройки, среднюю часть западной стены выломали до самого свода, объединив внутренние объемы пристройки и собора. В результате образовалось подобие вытянутого высокого прохода со световым барабаном, как бы случайно поставленным над его восточным концом.
Сейчас трудно представить былую красоту интерьера Успенского собора. По роскоши убранства он выделялся не только среди остальных храмов монастыря, но и принадлежал к числу наиболее богатых на Руси. Сама удаленность монастыря обладала как бы дополнительной притягательной силой. К нему стекались богатые вклады не только деньгами, но и драгоценной утварью, иконами, шитьем, книгами, облачениями. Об убранстве собора можно судить по самой ранней из сохранившихся описей монастыря 1601 года, в которой о каждой вещи рассказано емким, образным языком того времени. Особое внимание в ней уделено четырехъярусному иконостасу, оклады икон которого украшали жемчуг, драгоценные камни, гривны, цаты, венцы; открытыми оставались только лики и руки изображений. Под местными иконами помещался целый ряд шитых икон-пелен. Каждая икона имела пелену "праздничную" и "повседневную" на тот же сюжет. Над местным рядом на брусе, расписанном по красному фону разными травами, вплотную стояла 21 икона деисусного ряда. Сохранилось описание уборов для икон: "В деисусе же у семи образов гривны серебряные, золоченые, басмяные, а в них 18 камней розными цветы, да раковина жемчужная, да у 14 образов гривны серебряные, золочены, басмяны, да 84 гривны витые, серебряные, золочены, да 6 понагей... да 11 икон резаны на костех... В деисусе же 19 свечников деревянных, золоченых".
Над деисусными иконами стояли 25 праздничных икон. Завершался иконостас пророческим рядом: поясные изображения пророков были сгруппированы по 2-3 на каждой доске. Тябла верхних ярусов были резные, золоченые. Стены и столбы церкви опоясывали ряды икон в киотах резных, расписных, золоченых, обложенных просечным оловом на цветной слюде. И здесь у икон помещались пелены, всего же в соборе их было около сорока. Клиросы, аналои, шкафчики, скамьи, тощие свечи - все украшалось росписью и резьбой. Практически не было ни одной неукрашенной вещи. Освещался собор шестью паникадилами разнообразного устройства.
Иконостас в Успенском соборе считался по тому времени одним из самых больших на Руси. Начало созданию таких грандиозных ансамблей положил Андрей Рублев, который в 1408 году написал со своей артелью для Успенского собора Владимира более 80 икон. Рублевский иконостас надолго стал образцом для создававшихся вновь иконостасов в крупных соборных храмах. Подобных иконостасов в XV веке создавалось немало, но в наиболее полном виде дошел только иконостас из Успенского собора Кирилло-Белозерского монастыря. Его почти пятисотлетняя история полна событиями. Уже через 40 лет после написания все иконы стали обивать серебряными позолоченными басменными окладами, которые остались и поныне на деисусных и праздничных иконах. В 1630 году добавили еще один ярус из 25 икон - праотеческий. Хотя иконы для Успенского собора создавались в Москве на вклад знатного боярина Василия Ивановича Стрешнева, писал их вологодский иконник Ждан Дементьев, известный по работе в вологодском Софийском соборе. Позже, в 1645 году первоначальные царские врата заменили новыми, пожалованными царем Михаилом Федоровичем,- в великолепном серебряном позолоченном чеканном окладе прекрасной московской работы, сохранившимся до сих пор. Хорошо сохранившиеся оклады такого же рисунка получили тогда и местные иконы.
Существенно переделали иконостас в XVIII веке (после 1764 года). Древнюю тябловую конструкцию, при которой иконы вплотную рядами стояли на украшенных брусьях, в 1757 году заменили заурядным резным позолоченным иконостасом работы вологодского мастера резного цеха Василия Федоровича Деньгина, который сохранился до нашего времени. В XIX веке и без того невыразительную резьбу перезолотили, положив еще один толстый слой грунта. На многие местные иконы при перестройке иконостаса одели серебряные чеканные ризы. Значительная часть древних икон в новом иконостасе не поместилась, и их убрали. В праздничном ряду их оставили только 15, в деисусном - 16, а пророческий ряд убрали целиком, так как его длинные доски не укладывались в новую схему расстановки икон. Обойтись вообще без пророческого ряда было нельзя, поэтому под иконами местного ряда в "тумбах" вместо пелен написали на особых вставных досках полуфигурные изображения пророков. По-ремесленному робкая живопись, по-видимому, выполнена монастырскими иконописцами.
Долгое время убранные из иконостаса древние иконы стояли в алтаре, а затем их постепенно стали вывозить из монастыря и след многих потерялся. Оставшиеся в иконостасе памятники были очень изменены многочисленными поновлениями и не привлекали особого внимания. В местном ряду осталась только одна икона 1497 года - "О Тебе радуется", две другие находятся теперь в Третьяковской галерее, в том числе и храмовая главная икона "Успение". Остальные, стоящие сейчас в местном ряду иконы относятся к более позднему времени: "Неопалимая купина" к XVI веку, "Троица", "Предста Царица" к XVII веку и т. д.
В конце 1960-х годов приступили к реставрации икон 1497 года из Успенского собора. Длилась она несколько лет и сейчас полностью закончена. За это время в разных музеях обнаружили попавшие туда сложными путями иконы 1497 года, принадлежавшие Успенскому собору. В итоге оказалось, что уцелело около 60 икон, из них - 34 на месте, в Кириллове.
Необычно уже само по себе такое большое количество произведений XV века, происходящих из одного памятника. Иконы, созданные первоклассными художниками, стали огромным вкладом в общую сокровищницу древнерусского искусства. Две иконы 1497 года из Успенского собора - храмовое "Успение" и "Одигитрия" долгое время приписывали либо самому Рублеву, либо художникам его круга. Они выдерживают сравнение с прославленными шедеврами. Иконостас создавала группа художников. Те, которые написали храмовое "Успение", "О Тебе радуется", праздничные иконы "Вход в Иерусалим", "Рождество Христово", "Сретение", действительно следовали традициям рублевского искусства. Созданные ими образы одухотворены и лиричны, живопись по-московски изысканна.
Успенский иконостас чрезвычайно интересен. По нему можно судить о сложных процессах развития древнерусской живописи. В конце ХV века наблюдается тенденция сглаживания особенностей разных школ иконописания, складывается общерусский стиль. И, пожалуй, нигде так ярко этот процесс не удается проследить, как на иконах из Успенского собора. Кроме "московской" здесь есть и другая группа икон, например, праздничные иконы - "Распятие", "Сошествие Св. Духа", "Преображение", "Успение", в которых ощущаются черты новгородской живописи - суровость образов, подчеркнутость силуэтов, сочность обильно используемых художниками пробелов. Еще более интересно, что в некоторых иконах черты московской и новгородской живописи слиты воедино, например, в "Крещении", "Сошествии во ад", в деисусных - "Апостол Петр", "Мученики Дмитрий и Георгий", "Иоанн Предтеча", причем некоторые иконы из этих условных групп в иконостасе созданы одними и теми же художниками. В особую, неповторимо индивидуальную группу входят деисусные иконы "Иоанн Богослов", "Андрей Первозванный", святители, праздничные иконы на тему страстей Господних.