В 1780 году Прохор тяжко заболел, и все тело его распухло. Ни один врач не мог определить вида его болезни, но предполагали, что это сделалась водяная болезнь. Недуг длился в продолжение трех лет, из которых не менее половины Прохор провел в постели. Строитель о. Пахомий и старец о. Исайя попеременно ходили за ним и почти неотлучно находились при нем. Тут-то и открылось, как все, и прежде других начальники, уважали, любили и жалели Прохора, бывшего тогда еще простым послушником. Наконец стали опасаться за жизнь больного, и о. Пахомий настоятельно предлагал пригласить врача или, по крайней мере, открыть кровь. Тогда смиренный Прохор позволил себе сказать игумену: «Я предал себя, отче святый, истинному Врачу душ и телес, Господу нашему Иисусу Христу, и Пречистой Его Матери, если же любовь ваша рассудит, снабдите меня, убогого, Господа ради, небесным врачевством — причастием Св. Тайн». Старец Иосиф по просьбе Прохора и собственному усердию особо отслужил о здравии больного всенощное бдение и литургию. Прохор был исповедан и причащен. В скором времени он выздоровел, что весьма удивило всех. Никто не понимал, как мог он столь скоро оправиться, и только впоследствии о. Серафим открыл тайну некоторым, и в том числе любимой сестре Дивеевской общины, церковнице Ксении Васильевне (монахине Капитолине). После причащения Св. Тайн ему явилась Пресвятая Дева Мария, в несказанном свете, с апостолами Иоанном Богословом и Петром, и, обратясь к Иоанну лицом и указывая перстом на Прохора, Владычица сказала: «Этот от нашего рода!» «Правую-то ручку, радость моя, — говорил о. Серафим церковнице Ксении, — положила мне на голову, а в левой-то ручке держала жезл, и этим-то жезлом, радость моя, и коснулась убогого Серафима; у меня на том месте, на правом бедре-то, и сделалось углубление, матушка, вода-то вся в него и вытекла, и спасла Царица Небесная убогого Серафима; а рана пребольшая была, и до сих пор яма-то цела, матушка, погляди-ка, дай ручку!» «И батюшка сам, бывало, возьмет да и вложит мою руку в яму, — прибавляла матушка Ксения, ныне Капитолина, — и велика же она была у него, так вот весь кулак и взойдет!» Много душевной пользы принесла Прохору эта болезнь: Дух его окреп в вере, любви и надежде на Бога.
В период послушничества Прохора, при настоятеле о. Пахомий, предприняты были в Саровской пустыни многие нужные постройки. В числе их на месте кельи, в которой болел Прохор, строилась больница для лечения недужных и успокоения престарелых и при больнице церковь о двух этажах с престолами, в нижнем — во имя свв. Зосимы и Савватия, чудотворцев Соловецких, в верхнем — во славу Преображения Спасителя. Прохор, после болезни молодой еще послушник, был посылаем за сбором денег в разные места на сооружение церкви. Благодарный за свое исцеление и попечение начальства, он с охотой понес трудный подвиг сборщика. Странствуя по ближайшим к Сарову городам, Прохор был и в Курске, на месте своей родины, но не застал уже матери своей в живых. Брат Алексей, со своей стороны, оказал Прохору немалую помощь для построения церкви. Вернувшись домой, Прохор, как искусный столяр, построил собственными руками престол из кипарисного дерева для нижней больничной церкви, в честь преподобных Зосимы и Савватия.
В течение восьми лет юный Прохор был послушником. Наружный вид его к этому времени изменился; будучи высокого роста, около 2 аршин и 8 вершков, несмотря на строгое воздержание и подвиги, он имел полное, покрытое приятной белизной лицо, прямой и острый нос, светло-голубые глаза, весьма выразительные и проницательные, густые брови, светло-русые волосы на голове. Лицо его окаймлялось густой окладистой бородой, с которой на оконечностях рта соединялись длинные и густые усы. Он обладал большой физической силой, имел мужественное сложение, увлекательный дар слова и счастливую память. Теперь он прошел уже все степени монастырского искуса и был способен и готов принять монашеские обеты.
13 августа 1786 года с соизволения Св. Синода о. Пахомий постриг послушника Прохора в сан инока. Восприемными отцами его при пострижении были о. Иосиф и о. Исайя. При посвящении ему было дано имя Серафима (пламенный), и в братских ведомостях сказано, что он был пострижен в монахи на вакантное место в Гороховский Николаевский монастырь, в котором и числился значительное время, хотя никогда в нем не жил. В октябре 1786 года монах Серафим по ходатайству о. Пахомия был посвящен преосвященным Виктором, епископом Владимирским и Муромским, в сан иеродиакона. Он вполне предался новому своему, поистине уже ангельскому служению. Со дня возведения в сан иеродиакона он, храня чистоту души и тела, в течение пяти лет и девяти месяцев почти беспрерывно находился в служении. Все ночи на воскресные и праздничные дни проводил в бодрствовании и молитве, неподвижно стоя до самой литургии. По окончании же каждой Божественной службы, оставаясь еще надолго в храме, он по обязанности священнодиакона приводил в порядок утварь и заботился о чистоте алтаря Господня. Господь, видя ревность и усердие к подвигам, даровал о. Серафиму силу и крепость, так что он не чувствовал утомления, не нуждался в отдыхе, часто забывал о пище и питии и, ложась спать, жалел, что человек, подобно ангелам, не может беспрерывно служить Богу. Строитель о. Пахомий теперь еще более прежнего привязался сердцем к о. Серафиму и без него не совершал почти ни одной службы. Когда он выезжал по делам монастыря или для служения один или с другими старцами, то часто брал с собой о. Серафима. Так, в 1789 году в первой половине июня месяца о. Пахомий с казначеем о. Исайей и иеродиаконом о. Серафимом отправился по приглашению в село Леметь, находящееся в 6 верстах от нынешнего города Ардатова Нижегородской губернии, на похороны богатого благодетеля своего помещика Александра Соловцева и заехали по дороге в Дивеево навестить Агафью Семеновну Мельгунову, высокочтимую всеми старицу и также благодетельницу свою. Мать Александра была больна и, получив от Господа извещение о скорой кончине своей, просила отцов-подвижников, ради любви Христовой, особоровать ее. Отец Пахомий сперва предлагал отложить елеосвящение до возвращения их из Лемети, но святая старица повторила свою просьбу и сказала, что они ее не застанут уже в живых на обратном пути. Великие старцы с любовью совершили над ней таинство елеосвящения. Затем, прощаясь с ними, мать Александра отдала о. Пахомию последнее, что имела и накопила за годы подвижнической жизни в Дивееве. По свидетельству жившей с ней Девицы Евдокии Мартыновой своему духовнику протоиерею о. Василию Садовскому, матушка Агафья Семеновна передала строителю о. Пахомию мешочек золотом, мешочек серебром и два мешка меди, суммой в 40 тысяч, прося выдавать ее сестрам все потребное в жизни, так как они сами не сумеют распорядиться. Матушка Александра умоляла о. Пахомия поминать ее в Сарове за упокой, не оставлять и не покидать неопытных послушниц ее, а также попещись в свое время об обители, обетованной ей Царицей Небесной. На это старец о. Пахомий ответил: «Матушка! Послужить по силе моей и по твоему завещанию Царице Небесной и попечением о твоих послушницах не отрекаюсь, также и молиться за тебя не только я до смерти моей буду, но и обитель вся наша никогда благодеяний твоих не забудет, а в прочем не даю тебе слово, ибо я стар и слаб, но как же и браться за то, не зная, доживу ли до этого времени. А вот иеродиакон Серафим, духовность его тебе известна, и он молод, доживет до этого, ему и поручи это великое дело».