Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют ведущей или «направляющей». Ведущая цепь специфически связывается с молекулой мРНК и запускает разрезание белком. Такая длина (порядка 20–21 нуклеотидов) двухцепочечных фрагментов РНК увеличивает специфичность приклеивания ведущей цепи к мРНК. Если взять коплементарный участок большей длины, то склеивание займет больше время, а если его сделать короче, то сила сцепления склеенных участков уменьшится (135).
Приклеивание приводит к тому, что зрелая мРНК не может быть использована рибосомой и после долгого стояния отделяется от нее, разрушается с концов РНК-азами, а двойной участок снова попадает в РИСК и снова наша короткая комплементарная РНК оказывается готова к тому, чтобы инактивировать следующую молекулу мРНК. Процесс идет до тех пор, пока все мРНК не будут инактивированы. Тогда короткие цепочки РНК разрушаются РНК-азами и клетка снова может синтезировать мРНК с нашего белка. То есть введение коротких интерферирующих цепей РНК дает временный эффект по блокированию синтеза выбранного белка.
Другим методом является введение в геном с помощью микроинъекции, перфорирования или инфицирования вирусом генов, содержащих комплементарные участки, которые после синтеза незрелой РНК склеиваются друг с другом, образуя шпильки с петелькой на конце (что напоминает теннисную ракетку). Эта шпилька отрезается белками типа Дайсер и нарезается на короткие фрагменты длиной 20–25 нуклеотидов и затем в цитоплазме РИСК разделяет две цепи и образует одиночную цепь, способную приклеиваться к мРНК от выбранного белка. Обычно ген либо просто вводится, либо встраивается в геном так, чтобы он мог быть активирован особым стимулятором, который вводится в среду, где растут клетки.
Не всегда можно с уверенностью предположить, успеют ли комплементарные мРНК склеиться с короткой РНК или нет, пока ее не захватит рибосома. Насколько сильно наслаиваются склеивающиеся цепи РНК зависит степень нарушения, а также от продолжительности жизни мРНК.
Если длина комплементарной склейки достигает 20 и более нуклеотидов, то прочность склейки становится значительной и склеенные участки не позволяют рибосоме передвигаться вдоль мРНК. Рибосома встает перед местом склейки и затем распадается на две субъединицы. Синтез белка останавливается. После прекращения синтеза белка рибосома распадается и мРНК содержащая склейки, или две склеенные молекулы мРНК становятся жертвами Дайсера и РИСКа. Тем самым блокируется синтез белка. Совершенно не ясно, успеет ли комплементарные мРНК склеиться или нет, пока ее не захватит рибосома. Или же рибосома встает перед местом склейки и затем распадается на две субъединицы.
II.23. НОКАУТЫ ГЕНОВ
Вторым способом, использования способности нуклеиновых кислот интерферировать в местах, где цепи нуклеотидов, комплементарных друг другу, стал метод удаления генов или их мРНК. Используется два подхода: нокаут гена и нокдаун гена. Нокаут гена (англ. gene knockout) — это метод при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, изменённый так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию или химерный ген вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист (ранняя стадия эмбриона)суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.
Чтобы встроить ген в кольцевую ДНК, которая чаще всего используется для внедрения гена в клетку, применяют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и кольцевую ДНК можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген, а затем заключая его в ту самую кольцевую ДНК. Кольцевые ДНК, используемые для введения инородного гена в геном, часто называют векторами.
Ученые научились внедрять в клетки гены, которых у них ранее не было. Делается это обычно путем продырявливания плазматических мембран. Через дырки в цитоплазмы поступают гены в составе кольцевой ДНК. В сущности, процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.