У эукариот (клеток с ядрами) нокаут гена (разрушение здорового гена) производят путём использования феномена гомологичной рекомбинации (обмена нуклеотидными последовательностями) между сравнительно небольшим участком инородной (экзогенной) и клеточной ДНК.
Трансформированные эмбриональные стволовые клетки вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации.
Вектор, используемый для нокаута, несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; удаление одного или нескольких экзонов; делеция (удаление) промоторной (стимулирующей) области, расположенной перед самим геном; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер, на основе которого синтезируется белок, делающий несущие его клетки устойчивыми к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность нуклеотидов должна быть окружена с обеих сторон неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация (взаимообмен) с ДНК в хромосоме.
При этом существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции. Им может служить ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Клетки, в которых взаимообмен (рекомбинация) прошел неправильно синтезируют данный токсический ген и погибают. Остаются лишь небольшое количество клеток, где рекомбинация прошла там, где надо. Как все это делается подробно описано в методических книжках. Я не буду загружать вашу память. Кто хочет, может найти эти сведения в Интернете.
Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году, что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение нашего вектора в эмбриональные стволовые клетки возможно с помощью микроинъекции, химического (помощью липидов или других веществ) или физического (электропорация) кратковременного перфорирования плазматической мембраны, или с помощью заражения клеток вирусом, в геном которого встроен наш вектор. Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор.
После того, как линия трансформированных клеток получена и поддерживается, их вносят в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Затем содержащий наши клетки химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным, пока не будет получена гомозиготная линия. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации. Не все гены можно инактивировать на стадии зародыша — для них существуют боле сложные генно-инженерные методы.
II.24. РОЛЬ СКЛЕИВАНИЯ (ИНТЕРФЕРЕНЦИИ) РНК
Зачем на самом деле нужны механизмы, служащие для процессинга (разрушения) малых РНК? Пока такие гены найдены только у червя (173). Думаю, что механизм по разрушению двойных цепей РНК в клетке был разработан природой для борьбы с гибридизационными осложнениями. Склеивание двух мРНК или внутримолекулярное склеивание одной мРНК может вести к блокированию синтеза белков в определенных ситуациях, когда сам белок не изменен ни на йоту. Эксперименты на червях лучше всего объясняются с этих позиций.
Гибридизационые мутации накапливаются в экзонах и интронах, которые могут в данный момент не использоваться в данной клетке. Многие гены молчат, но накапливают иммуногенные мутации, которые выявляются иммунной системой. Система РНК-интерференции играет также важную роль в защите клеток от паразитирующих генов и вирусных генов. Считается, что РНК-интерференция является защитным механизмом, предохраняющим клетку от РНК-вирусов и мобильных генетических элементов (транспозонов).