В чест на подписването на мира се провежда голям рицарски турнир, а четиридесетгодишният крал настоява да играе дейна роля в двубоите. По време на един от тях едно дървено копие се удря в шлема му и една от треските се забива в черепа му. Викат най-добрите лекари в Европа, дори и Андреас Везалий, но нищо не могат да направят. Анри II умира за броени дни.
Болнавият петнадесетгодишен син на Катерина се възкачва на трона под името Франсоа II. Той обаче е владетел само на думи, тъй като реалната власт е в ръцете на двама благородници — братята дьо Гиз. Кардинал Шарл дьо Гиз поема външната политика, а херцог Франсоа дьо Гиз държи армията. Братята дьо Гиз са фанатични противници на протестантството и се радват на подкрепата на Испания и Папството.
Протестантството се разпространява из цяла Европа и привлича все повече и повече последователи сред недоволните и потиснати селяни. Тази класа е експлоатирана от феодализма още от началото на Средновековието и намира своя духовен ренесанс в Реформацията на Лутер. По този начин протестантството приема отчетливо политически оттенък, който става още по-ясно изразен, когато претоварените с данъци занаятчии и търговци започват да приемат протестантството, разпространяващото се из френските градове. Хугенотите, както стават известни френските калвинистки протестанти, започват да гледат на католическите власти като на свои врагове. Религиозният вододел става и политически, тъй като хугенотите говорят против Короната и правителството, макар че на практика тези протести бързо се потискат.
Положението се променя през 1559 година, когато към хугенотите се присъединяват недоволни благородници, които се чувстват ограничени от нарастващата власт на монархията и аристократичното управление. Разединените долни прослойки на обществото вече имат водачи и бунтът е назрял. Някогашните тайни срещи в домовете на приелите протестантството търговци вече стават обществени и се провеждат по площадите, като на тях говорят хугенотите благородници.
Хугенотите се обръщат към Катерина де Медичи като кралица-майка с молба да ограничи преследванията срещу тях от страна на братята дьо Гиз, които правят това в името на нейния млад син. Катерина започва да използва влиянието си като посредник, но през 1560 година Франсоа II умира и е наследен от десетгодишния си брат Шарл IX. Ако първородният син на Катерина се оказва разочарование, то вторият е още по-голямо — генетичното наследство от баща му, съчетано с това от бащата на Катерина, сифилитичния херцог на Урбино Лоренцо, е злокобна смесица. Подобно на своя по-голям брат и Шарл IX е физически слаб, но освен това страда от душевно разстройство.
Този път Катерина е решена да поеме нещата в свои ръце и да бъде назначена за регент — целта й е да запази мира на всяка цена. Протестантите вече имат някакви права, които на практика обаче до голяма степен се пренебрегват във все по-враждебната атмосфера, която поглъща страната. Катерина може да създава закони, но няма власт да ги налага и през 1562 година във Франция пламва гражданска война. На следващата година херцог Франсоа дьо Гиз е застрелян от шпионин, докато обсажда протестантите в Орлеан. По време на процеса шпионинът признава, че е нает от водача на хугенотите адмирал дьо Колини.
С прекратяването на гражданската война през 1563 година Шарл IX е обявен за пълнолетен от парламента в Руан и през следващите две години Катерина води младия крал на дълга обиколка из Франция, за да се представи на народа и да завоюва неговата вярност. Кликата на дьо Гиз и техните крайни католически поддръжници са за гражданска война, която отново избухва през 1567 и 1568 година. Катерина прави всичко по силите си, за да постигне примирие — води преговори с фракцията на дьо Гиз и дори кани адмирал дьо Колини да се срещне с краля. Случва се така, че когато Колини пристига в Париж, Катерина не е там, защото е отишла да се грижи за дъщеря си херцогиня Клод дьо Лорен, която е болна. Колини използва цялото си обаяние пред стеснителния и впечатлителен млад Шарл IX. Седят заедно и говорят до късно през нощта в кралските покои в Лувъра. Изглежда, че Колини се опитва да узурпира влиянието на Катерина над краля, до нея достигат новините за това и, обладана от ярост, тя бързо се връща в Париж, където възстановява властта си над слабоволевия Шарл IX.