В опит да скрепи примирието между двете фракции Катерина урежда дъщеря й Маргьорит да се омъжи за младия водач на хугенотите Анри дьо Навар, в чиито вени тече кръвта на Бурбонския кралски род. През август 1572 година в Париж се събират водачите на католиците и хугенотите, за да присъстват на бракосъчетанието. Камбаните на Нотр Дам и камбанариите из целия град изпълват столицата със своя звън, привидно народът се радва, но атмосферата по улиците остава тревожна, а Париж изнемогва в летните жеги. Папата дава да се разбере, че е против брака, и обявява, че не може да има съюз между католици и протестанти. Вследствие на това церемонията не може да бъде проведена в Нотр Дам, а е извършена на площада непосредствено пред катедралата. По време на нея хугенотите показно „отиват на разходка“, когато идва моментът да бъде отслужена литургия в прослава на младоженците.
След четири дни, когато празненствата са в своя зенит, в сряда, 20 август, се опитват да убият Колини. Стрелят по него с аркебуз от един от горните прозорци, когато минава по улица дьо Бетиси (сега улица дьо Риволи), но точно в този миг Колини се навежда, за да затегне обувката си и само е ранен. Разбират, че къщата, от която е стреляно с аркебуза, принадлежи на човек от свитата на рода Гиз и става очевидно, че се опитват да си отмъстят за убийството на херцог Франсоа дьо Гиз.
Катерина и Шарл IX бързо отиват при ранения Колини, който пожелава да говори насаме с краля. По обратния път към Лувъра Катерина принуждава Шарл IX да й каже какво му е казал Колини в тайния им разговор — става ясно, че адмиралът предупреждава краля да не се доверява на Катерина. По това време Париж вече е обзет от вълнения — 200 хугеноти завземат дома на дьо Гиз на улица дьо Бетиси, а по улиците бродят въоръжени групи от техни привърженици. Гражданите се изпокриват в домовете си, пазарите и магазините затварят.
Трябва да се вземат бързи мерки или положението в столица ще излезе извън контрол, като най-вероятно отново ще бъде разпалена гражданската война из цяла Франция. На следващия ден дават на Шарл IX доказателства, че всъщност Колини възнамерява да го нападне. Свидетелите разказват, че когато научава за измяната на своя нов приятел, кралят обезумял. Не знаем със сигурност дали Шарл IX действа сам или под давление на своята майка, но рано сутринта в неделя на 24 август, празника на свети Вартоломей, войници от Швейцарската гвардия, начело с представител на фракцията на дьо Гиз проникват в дома на Колини и го намушкват, след което изхвърлят тялото през прозореца на улицата. Това е сигналът кралските войски, подпомагани от католиците в Париж, да започнат клането над хугенотите. Мъже, жени и деца са измъквани от леглата им, влачени по улиците на града и избивани в една кървава вакханалия, продължила два дни — убити са 2 500 души. Новината за Вартоломеевата нощ плъзва из Франция и подобни кланета се случват в Орлеан, Руан, Лион, Бордо и Тулуза — загиват общо 8 000 души. Това е началото на поредицата от религиозни войни, които опустошават Франция през следващите тридесет години.
Доста вероятно е Катерина де Медичи поне отчасти да носи отговорност за клането във Вартоломеевата нощ. Не знаем със сигурност дали изгубва контрол, или просто смята;, че това е единственият изход, но същевременно не бива да се съмняваме, че ако не е нанесла удара първа, животът ѝ, както и този на краля, е щял да бъде в голяма опасност. При всички случаи Катерина де Медичи е обвинявана за кървавото разчистване на сметки, което е едно от най-позорните дела във френската история. От този миг нататък на нея гледат като на водач на католическа Франция в борбата й срещу хугенотите.
Сведенията за въздействието на това дело върху самата Катерина де Медичи се различават. Според едни, тя никога не се възстановява напълно, сега, когато навлиза в петдесетте години на своя живот, манипулативният й характер придобива по-остър и циничен оттенък, а набитата й фигура става отпусната и отблъскващо дебела. Други пък разказват, че остава все така дейна, ходи на лов, танцува и е все толкова остроумна — Франция е разделена непримиримо, дори в мнението си за своята властваща кралица.
През 1574 година само на двадесет и четири годишна възраст умира Шарл IX и любимият трети син на Катерина се възкачва на трона под името Анри III. Катерина не изпитва почти никакви надежди за Шарл IX, но очакванията й за двадесет и три годишния Анри III са големи, въпреки че много добре съзнава слабостите му. Анри III е резервиран и почти няма приятели извън своя тесен кръг от сподвижници, известни като „миньоните“ („хубавците“). Един съвременник пише: „Всички се обличат в еднакви разноцветни дрехи, пудрят се с виолетова пудра и други сладникави парфюми.“ Изглежда, че Катерина приема като неизбежна хомосексуалността на един толкова слаб син с прекалено властна майка като нея. Патологичната екстравагантност на Анри III обаче събрана с интереса му към ревностно религиозно бичуване намеква за отклонения, по-големи от нормата. Два дни след коронацията той се жени за Луиз дьо Лорен, за да подсигури толкова нужния на династията Валоа наследник. Но такъв няма.