След седем години приятелят му Матео Барберини става папа Урбан VIII и Галилео, изпълнен с оптимизъм, заминава за Рим, за да защити своята теза. До известна степен Урбан VIII запазва своите симпатии и дава разрешение на Галилей да напише книга за „системите в света“. В нея може да изложи както гледната точка на Коперник за вселената, така и тази на Църквата, стига ясно да покаже, че църковната е правилната. Галилео написва „Диалог за двете главни системи в света“, в който излага възгледите на Коперник чрез остроумния интелектуален герой Сагредо, а Църквата и нейната аристотелианска гледна точка е представена от героя Симплицио. За нещастие Галилео и този път се увлича, в резултат на което Симплицио изглежда прекалено глупав. Нещо по-лошо, мнозина смятат, че в него разпознават олицетворение на самия папа. Урбан VIII е бесен, а съветниците му го подстрекават, като настояват, че подобни идеи само способстват за подкопаване на цялата Контрареформация. По това време Европа е в разгара на Тридесетгодишната война — разрушителният конфликт между католическите и протестантските войски, обхванал целия континент. В ужаса, обзел тогава всички, идеите на Галилей са обявени за по-зловредни „от Лутер и Калвин взети заедно“.
За нещастие закрилникът на Галилео и негов бивш ученик великият херцог Козимо II умира през 1621 година. Няма кой да го защити и той получава заповед да се яви в Рим, където през 1633 година започва процес срещу него по обвинение в ерес. Тридесет години по-рано философът и учен Джордано Бруно е обвинен в същото в Рим и всичко свършва с изгарянето му на клада. Галилео осъзнава, че се намира в смъртна опасност, сега е на шестдесет и осем години, здравето му се влошава, но се отправя към Рим. Бързо отстъпва, когато е изправен пред перспективата да бъде подложен на мъчения от страна на Инквизицията. Принуждават го тържествено да се закълне, че „се отрича, проклина и ненавижда“ своето твърдение, че земята се върти около слънцето, макар че според легендата не успява да се въздържи да не промълви под носа си: „И все пак тя се върти.“
Галилео е осъден на доживотен затвор, но заради възрастта и влошеното му здраве му позволяват да се върне в Тоскана. Тук под любезната закрила на новия велик херцог Фердинандо II излежава своята присъда под домашен арест в малкото си имение в Арчетри на юг от Флоренция. След четири години започва да губи зрението си, но изобщо не е съсипаният човек, който изглежда на пръв поглед. Славата му подсигурява посещенията на няколко изтъкнати пътешественици от Северна Европа, в това число и на английския философ Томас Хобс и поета Джон Милтън. Месец преди Галилео да потъне в пълна слепота чрез наблюдения през своя телескоп открива, че луната се върти около своята ос, докато се върти около земята. Малко по-късно завършва своя последен шедьовър „Двете нови науки“, в който обобщава идеите си. Ръкописът е пренесен тайно в Холандия, където е публикуван и разпространен между учените в цяла Европа. На 8 януари 1642 година Галилео умира на седемдесет и седем годишна възраст, само няколко месеца преди в Англия да се роди Исак Нютон. Триста и петдесет години по-късно Ватикана най-после признава, че в случая с Галилео „са допуснати грешки“.
„Помилването“ бележи значително отстъпване от позициите, тъй като по време на смъртта на Галилео Църквата изобщо не е в настроение да прощава простъпките му, а някогашният му приятел Урбан VIII остава особено отмъстителен. Когато великият херцог Фердинандо II повелява Галилео да бъде погребан в „Санта Кроче“, в която се намират гробовете на всички велики флорентинци като Гиберти, Макиавели и Микеланджело, папата забранява. Позволяват Галилей да бъде погребан по християнски обичай в „Санта Кроче“ чак седемдесет и пет години след смъртта му.
Великият херцог Фердинандо II изпитва голям интерес към дейността на Галилео и след като става пълнолетен и се възкачва на престола през 1632 година, от двореца Пити към учения често са оправяни поръчки за осигуряването на най-модерния телескоп за Негово височество. Фердинандо II особено се гордее с Медичиевите звезди, които гордо показва на изтъкнатите си гости през своя нов телескоп. През 1635 година, след като Урбан VIII осъжда „Диалог за двете главни системи в света“ на Галилей, Фердинандо II прави всичко по силите си, за да запази книгата и да я разпространи. Малкият му брат Матиас де Медичи пренася тайно ръкописно копие на произведението от Флоренция в Северна Европа, където е преведено и издадено на няколко езика. Когато Хобс посещава Галилео по време на домашния му арест, съобщава на възрастния учен, че се е сдобил с английски превод на „Диалога“.