Он становится первым медиком, поставившим себе целью изучение строения живого организма с помощью микроскопа и выработавшим систематику и методологию микроскопического исследования
В альма-матер он с головой уходит в научную работу. Ему не терпится пристальнее рассмотреть различные органы и ткани. В исследованиях ученого отныне постоянно присутствует хоть и слабенький (всего 180-кратный), но микроскоп, и Мальпиги надеется на свой острый глаз и развитые еще в детстве фантазию и логику. Однажды, рассматривая в микроскоп легкое препарированной лягушки, ученый замечает, что оно состоит из мелких пузырьков, покрытых пленкой, и в этой пленке проглядывается сеть мельчайших кровеносных сосудов, соединяющая мелкие артерии и вены. Разгадка вопроса, который так и не был разрешен Гарвеем, открывшим круги кровообращения, но не знавшим, где артериальная кровь становится венозной, обнаружилась по ту сторону микроскопа у Мальпиги. В 1661 году ученый публикует статью о своем открытии в престижном журнале Лондонского королевского общества и, как бы ни злобствовал его давний противник профессор Монтальбани, находит поддержку у большей части коллег и соратников, в том числе у своего любимого учителя профессора Мариани. К сожалению, времени разделить с наставником радость научной победы Мальпиги досталось слишком мало: в 1662 году Мариани скоропостижно умирает, и Марчелло, удрученный и опустошенный потерей, принимает предложение возглавить кафедру медицины в университете Мессины. Там он четыре года занимается изучением растений, их анатомией и физиологией, все более виртуозно применяя микроскоп.
В 1666 году ученый вновь возвращается на кафедру Болонского университета. Его имя к тому времени известно далеко за границами родины, и спустя год Мальпиги соглашается на предложение вести регулярную переписку с Лондонским королевским обществом, полноправным членом которого становится в 1669-м. Английские ученые дали высокую оценку подробной монографии об анатомии шелковичного червя, написанной по предложению Королевского общества, и торжественно разместили портрет Мальпиги на почетном месте в одном из залов в Лондоне.
В 1669 году Мальпиги становится полноправным членом Лондонского королевского общества.
В своих изысканиях для лучшей визуализации ученый применяет особые методы обработки исследуемого материала: кипячение, мацерацию, обработку специальными веществами. Он становится первым медиком, поставившим себе целью изучение строения живого организма с помощью микроскопа и выработавшим систематику и методологию микроскопического исследования. Мальпиги поражен объемом открытий, которые он с помощью микроскопа может совершать чуть ли не ежедневно. Благодаря этому прибору он обнаруживает почечные канальцы и формулирует первые представления о мочеобразовании. Открытые им структуры впоследствии называют мальпигиевыми тельцами в почках и селезенке, ростковым мальпигиевым слоем в коже, мальпигиевыми сосудами у насекомых. Ученый доказывает, что на языке есть три вида вкусовых сосочков и что слизистая оболочка кишечника имеет трубчатые углубления – крипты. В 1672 году с помощью микроскопа Мальпиги дополняет наблюдения Гарвея о развитии зародыша в яйце курицы. С 1675 по 1679 год ученый работает над двухтомником «Анатомия растений», в котором описывает растительные волокна и излагает свою теорию о восходящих и нисходящих токах сока. В предисловии к этому труду ставшему на многие десятилетия одним из главных учебников ботаники, автор пишет о том, что «только познавая простое, можно изучить и более сложное». Почти за два века до открытия механизма дыхания у живых организмов Мальпиги выявил тот факт, что для прорастания семян необходим воздух. Последователи великого ученого в ботанике увековечили его имя в названиях семейства двудольных свободно-лепестковых растений (Malpighiaceae) и вечнозеленого тропического кустарника мальпигии. Микроскопия с подачи Мальпиги становится привычным методом исследования в анатомии, биологии и медицине.