было сложной задачей из-за высокой скорости кристаллизации. Вот почему необходимым условием стало требование, чтобы толщина живых объектов не превышала 0,3 мм, причем содержание в них воды должно составлять не более 50 %. При более высоком содержании воды толщина объектов должна быть еще уменьшена. В большинстве проведенных опытов объектами служили или одноклеточные организмы, или тонкие листья растений. Культуры из одноклеточных организмов наносили тонким слоем на поверхность пластинки слюды толщиной 0,01 мм. Пластинку погружали в жидкий воздух, где микроорганизмы мгновенно замерзали. Размораживание осуществляли, перенося объекты в нагретый до 40 °C изопентан (жидкость, которая не смешивается с водой). При проведении некоторых опытов применялась нагретая ртуть, а при опытах с листьями растений и вода. Иногда объекты погружали даже в кипящую воду на 0,2 с, после чего немедленно переносили в холодную воду.
Весьма подходящий объект для опытов был найден американскими исследователями братьями А. и С. Гётцами в 1938 г. Они использовали обыкновенные дрожжи. С помощью кольца из платиновой проволоки они отделяли тонкую пленку с культурой дрожжей, при этом объект оказался достаточно тонким, чтобы его можно было охладить с большой скоростью. Погрузив пробу в изопентан при температуре -190 °C, ее переносили в бензиловый эфир, подогретый до комнатной температуры. Таким образом осуществлялось быстрое размораживание. Затем к культуре добавляли каплю водного раствора красителя (метиленового синего), который окрашивал только мертвые дрожжи. Применяя такой способ, можно было под микроскопом пересчитать погибшие клетки, а их оказалось тем больше, чем медленнее проводилось замораживание и последующее размораживание. Это объясняется увеличением возможности кристаллизации воды в клетке. Время, которое дрожжи находились в замороженном состоянии, не оказывало влияния. При одних и тех же условиях замораживания и оттаивания количество погибших клеток и после сточасового, и после пятиминутного замораживания было одно и то же. При самых благоприятных обстоятельствах количество оживающих клеток достигало 20 %. Разумеется, в природе такое быстрое охлаждение невозможно. Там всякое охлаждение сопровождается образованием льдинок, в теле организма.
В 1940 г. советский ученый А. Е. Крисе обнаружил спороносные и неспороносные микроорганизмы только на поверхности замерзшего слоя почвы.
В более поздних исследованиях (1948 г.) известный советский ученый П. Ю. Шмидт снова изучал анабиотическое состояние при замораживании, насекомых и некоторых животных с постоянной температурой тела. Он пришел к заключению, что в первый период после фазы переохлаждения не наступает полное замерзание организма, а начинают только появляться кристаллы в жидкостях и клетках организма. Следовательно, и анабиоз возможен только при условии, которое исключает полное замерзание всех клеток.
Позже, в 1949 г., А. Крисе вместе со своим соотечественником Т. Граве сообщил об исследованиях проб льда, полученных из зоны вечной мерзлоты, в результате которых установлено, что эти пробы не содержали микроорганизмов. По мнению исследователей, для окончательного выяснения вопроса о наличии микробов, находящихся в состоянии анабиоза в почве зон вечной мерзлоты, необходимы дополнительные опыты.
В 1947 г. советский ученый А. В. Каляев, соблюдая все правила асептики, исследовал ряд проб почвы, взятых в зонах вечной мерзлоты. Он установил, что пробы, полученные с больших глубин, содержали только спороносные микробы, а те, которые были взяты с более поверхностного слоя, — и неспороносные микробы. Исследования А. В. Каляева окончательно доказали, что микроорганизмы могут продолжительное время сохраняться в почве зоны вечной мерзлоты в анабиотическом состоянии.
Советский ученый Э. Я. Граевский за период с 1946 по 1948 г. подверг воздействию сверхнизких температур (-172 °C) животные и растительные объекты, такие, как амебы, сперматозоиды (лягушек, крыс и собак), а также чешуйки лука и культуры микробов. Исследователь установил, что после воздействия низких температур сперматозоиды лягушек, чешуйки лука и культуры микробов сохраняли свою жизнеспособность. При очень низких температурах в клетках не образовывались кристаллы, так как их цитоплазма тотчас же переходила в аморфное состояние, минуя фазу кристаллизации благодаря мгновенному воздействию холода.